靶向治疗药物与嵌合抗原受体T细胞疗法的联合治疗模式在血液肿瘤疾病中的应用

唐瑀彤 李杨子 唐晓文

目前血液肿瘤的治疗模式已逐步进入免疫治疗时代,其中嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)抗体靶向治疗并称为肿瘤免疫治疗的三大进展。多项临床试验结果已经证实,CAR-T在治疗复发难治性B细胞恶性肿瘤中可显著提高患者缓解率和生存率,但在急性髓系白血病(AML)及实体瘤中仍未取得实质性突破[1]。同时,CAR-T治疗后可能出现的严重不良反应如细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征及免疫逃逸导致的耐药复发等,均可使得CAR-T治疗失败。因此,我们需要不断探索新的治疗策略以提高CAR-T疗效、降低不良反应、扩大适应症和改善CAR-T患者的生存与预后。已有大量研究结果证实,各类靶向治疗药物如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、免疫检查点抑制剂和其他单抗等联合CAR-T治疗可有效增强其杀伤功能,同时减少CAR-T耗竭和改善免疫抑制微环境以克服CAR-T耐药,我们在本文将总结不同的靶向治疗药物和CAR-T联合治疗模式的研究进展。

一、小分子抑制剂

1.TKI

用于治疗慢性髓系白血病的第二代TKI达沙替尼不仅可有效抑制BCR-ABL融合基因,还可抑制Src家族激酶Lck。Lck的激活是T淋巴细胞(简称T细胞)受体通路启动的核心,在嵌合抗原受体与靶细胞抗原相结合后,激活的信号级联反应与T细胞受体类似。相关研究发现达沙替尼能有效抑制T细胞活化,被视为控制T细胞及CAR-T活化的开关[2],加入达沙替尼后可使CAR-T处于休眠状态,抑制其增殖和炎症因子释放;反之,达沙替尼被清除后,对CAR-T的抑制作用可迅速逆转且活性无明显的抑制作用[3]。另一方面,Katrin Mestermann团队发现达沙替尼可有效控制CD19 CAR-T输注后小鼠的CRS反应,使生存率由25%提高至70%,同样证实达沙替尼可作为CAR-T活性的可逆开关[4]。因此在临床上CRS的早期症状出现时,可尝试使用达沙替尼使CAR-T暂时休眠,以控制严重的CRS反应。另一方面,CAR-T耗竭也是CAR-T治疗后原发病复发的主要原因,浙江大学附属第一医院黄河团队证实加入达沙替尼可阻止甚至逆转CAR-T耗竭和终末分化而不影响CAR-T扩增,当靶细胞和CAR-T共培养,耗竭相关指标PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3、淋巴细胞活化基因(LAG)-3的表达明显下调,CAR-T的增殖能力却随之增强[5]。此外,在CAR-T制备过程中,加入达沙替尼可帮助生产更高质量的细胞,在一项使用CD5 CAR-T治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的临床试验中,加入伊布替尼和达沙替尼阻断tonic信号制备的CD5 CAR-T存留时间更长且效力和抗肿瘤活性增强[6]。其他特异性抑制Src激酶的TKI如普纳替尼和塞卡替尼,使用这些药物时,同样可通过抑制Src激酶介导的信号通路来强烈抑制CAR-T的细胞毒活性。

2.BTK抑制剂

BTK是B淋巴细胞(简称B细胞)受体信号通路的关键调节因子,在几乎所有造血细胞中均有表达,主要参与B细胞的增殖、分化与凋亡。在B细胞恶性肿瘤中,BTK的高表达使B细胞处于异常增殖活化状态,因此BTK抑制剂广泛运用于淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血症等疾病,其通过下调B细胞抗原受体通路的激活使恶性B细胞的增殖受抑制[7]。目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的BTK抑制剂包括伊布替尼、阿卡替尼和泽布替尼,其中伊布替尼已在复发难治性慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症患者中被批准作为一线治疗方案。伊布替尼不仅可抑制B细胞信号通路,还可抑制IL-2诱导的酪氨酸激酶通路,调节T细胞增殖、分化和细胞因子释放,改善免疫抑制微环境和增强免疫监视等[8]。许多研究已证实BTK抑制剂和CAR-T疗法治疗血液系统肿瘤具有显著的协同作用,其中以伊布替尼最为显著。伊布替尼和CAR-T的协同作用主要体现在以下几个方面:首先,华中科技大学协和医院梅恒团队将正常T细胞和CD19 CAR-T分别与3种BTK抑制剂药物(伊布替尼、泽布替尼、奥布替尼)共培养4天后,伊布替尼组T细胞PD-1、TIM-3和CTLA-4的表达水平均显著降低,泽布替尼次之,而奥布替尼组未出现相应改变,伊布替尼组还可防止CAR-T在长期培养和刺激中过度激活,并降低IL-6分泌[9];第二,伊布替尼可下调肿瘤细胞趋化因子受体CXCR4的表达并抑制下游信号传导,使得肿瘤细胞不能归巢至淋巴结,动员肿瘤细胞进入外周血从而被循环的CAR-T识别和杀伤,通过在结外识别和杀伤肿瘤细胞,可减少免疫微环境对CAR-T的负性调控,减少CAR-T耗竭[10];第三,伊布替尼可抑制CAR-T终末分化,增加记忆性T细胞比例,CLL患者随着疾病的进展本身存在一定程度的免疫失衡,其T细胞分布呈早期干细胞记忆性T细胞比例下降而终末效应型T细胞比例升高的状态,Leopold Sellner团队采集了9例健康供者和8例CLL患者外周血分离T细胞制备CAR-T,随后发现CLL患者来源T细胞加入伊布替尼共培养后,在第14天检测CAR-T转染效率由47%提升至59%,同时CD3+、CD3+/CD4+、CD8+T细胞中的干细胞样记忆性T细胞的比例和绝对计数显著提高[11];第四,伊布替尼可降低CAR-T治疗中CRS风险,减少相关炎症因子分泌。Ruella等[12]发现在体外联合伊布替尼和CD19 CAR-T治疗套细胞淋巴瘤,与CAR-T组比较,伊布替尼联合组显著降低了IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ等多种细胞因子分泌水平,但细胞毒性效果增强,随后进一步在动物模型中证明在体内伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗可显著降低复发率而T细胞增殖无明显受抑。Qin等[13]同样证实伊布替尼可显著降低CD19 CAR-T组IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌且呈浓度依赖趋势,阿卡替尼组则无类似现象。在临床研究方面,Gil等[14]开展了一项对伊布替尼单药治疗至少6个月而未获得完全缓解(CR)的晚期或高危CLL患者中进行人源化CD19 CAR-T治疗的临床试验,共19例患者进行CD19 CAR-T治疗,中位随访时间为42个月,CR率为43%,骨髓CR率高达94%,微小残留病(MRD)阴性率78%,所有患者均发生1次不良事件,18例患者发生CRS,但63.2%为1级CRS,显著降低了3～4级CRS发生率;2021年Siddiqi教授团队报道的研究结果同样证实伊布替尼和CD19 CAR-T联合治疗有利于提高CLL患者缓解率,该研究对比了接受CD19 CAR-T单药治疗的患者(对照组)和入组时继续或重新服用伊布替尼治疗并在输注后接受90天伊布替尼巩固治疗方案的患者(联合治疗组),与对照组相比较,联合治疗组总缓解率为95%,第30天时达到MRD阴性患者比例100%[15]。此外,在弥漫大B淋巴瘤中,Chavez教授团队报告了在白细胞采集前4周接受伊布替尼每日560 mg的治疗组患者T细胞及干细胞样中心记忆细胞的比例更高,且在抗原刺激下能分泌更高水平的IL-2和IFN-γ,随后CAR-T的扩增数也明显高于对照组(3.9×108比1.7×108)[16]。综上所述,临床研究数据结果已证实,伊布替尼联合CAR-T的治疗方案有望改善B细胞恶性肿瘤患者的疗效,在B细胞恶性肿瘤中是具有前景的治疗选择,但联合治疗的方案(序贯/联合)、最佳剂量、治疗时机仍在探索中。

3.Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)

JAK/STAT通路是细胞因子刺激的信号转导通路,异常的JAK/STAT通路激活可引起血液系统肿瘤在内的多种肿瘤的发生,使白血病细胞异常增殖,并与不良预后有关。JAK激酶是一类胞质非受体酪氨酸激酶,共有JAK1、JAK2、JAK3、TYK2四种亚型[17]。其中,JAK1在IL-6、IL-2、IL-4、IL-27、IL-9、IL-11等多种细胞因子和胸腺基质淋巴细胞生成素等的信号转导中发挥重要作用,突变常见于与AML和ALL;JAK2则参与红细胞生成、血小板活化和骨髓造血等功能,该基因突变常见于骨髓增殖性疾病如骨髓纤维化、原发性血小板增多症和真红细胞增多症等;JAK3仅表达于造血组织中,主要与CD8+T细胞免疫功能及自然杀伤(NK)细胞发育增殖、T细胞白血病、淋巴瘤和类风湿关节炎等有关。目前共有十余种JAK抑制剂批准上市,包括第一个获批的JAK抑制剂芦可替尼,二代JAK2抑制剂菲卓替尼等。由于JAK/STAT通路和多种细胞因子信号转导通路密切相关,目前主要认为JAK抑制剂可降低CAR-T治疗后CRS的风险。Kenderian等[18]首先在AML动物模型中证实,在输注CD123 CAR-T的同时给予芦可替尼可有效降低炎症因子的释放,但并不影响CAR-T抗白血病效应,与对照组比较,小鼠体重减轻症状得到改善且提高了生存率,将芦可替尼和CD19 CAR-T在体外进行联合培养,CAR-T在体内外的增殖和扩增受到抑制但杀伤功能不受影响。Xu等[19]同样证实芦可替尼可暂时抑制CAR-T的增殖、杀伤和细胞因子释放,芦可替尼撤药后,CAR-T的杀伤能力恢复但细胞因子释放能力仍被抑制。在临床研究中,使用芦可替尼可有效控制CAR-T治疗过程中发生的糖皮质激素耐药的CRS。Pan等[20]在一项临床研究中报道14例复发难治性小细胞淋巴瘤儿童在接受CD19/CD22 CAR-T治疗过程中,4例出现了3级以上激素耐药CRS,接受芦可替尼治疗后,CRS都在24小时内得到控制,所有患者在回输后第30天评估时都达到了CR。除JAK2的抑制剂芦可替尼外,近期Huarte等[21]研究报道治疗移植物抗宿主病的JAK1抑制剂伊他替尼也可以剂量依赖性方式在体内外降低IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ的分泌,采用临床相关剂量进行模拟时,伊他替尼并未抑制CAR-T增殖或抗肿瘤杀伤能力,证实伊他替尼或可用于预防CAR-T诱导的CRS发生,目前已开展伊他替尼用于预防CAR-T疗法治疗后CRS的Ⅱ期临床试验(NCT04071366)。虽然芦可替尼证实可降低CAR-T治疗后CRS发生的风险,但其对CAR-T扩增的抑制作用和降低Granzyme B和IFN-γ的水平仍值得关注,因此对于CAR-T扩增不佳的患者,不建议使用芦可替尼,另一方面,芦可替尼治疗过程中的潜在并发症如血小板减少和出血风险仍值得关注。

4.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂

mTOR通过参与信号通路PI3K-Akt-mTOR和Akt-TSC1-TSC2-mTOR-S6K调控细胞的生长,mTOR的激活可诱发凋亡,使细胞周期G1向S期的转换,在肿瘤的生长和转移中发挥着重要作用。此外,mTOR激活后的下游效应还包括促进代谢、调控糖酵解及脂肪和蛋白质合成,可帮助在低氧和营养缺乏下肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤微环境和免疫反应。mTOR同样参与T细胞的调控包括发育、激活和迁移,在T细胞的分化中,mTOR是记忆CD8+T细胞分化的调节因子,抑制mTOR的活性可显著提高记忆性T细胞的生成;而在CD4+T细胞中,mTOR信号的活化可促进Th1、Th2、Th17细胞分化,并抑制Treg细胞的分化[22]。目前,FDA批准的mTOR的抑制剂包括雷帕霉素、依维莫司和坦西莫司。Leclercq等[23]证实特定浓度范围内的mTOR抑制剂在体内和人源化淋巴瘤小鼠模型中可显著降低CD19-T细胞双特异性抗体释放的细胞因子而不影响其抗肿瘤能力,由于mTOR不影响T细胞的杀伤功能,因此,该研究团队认为mTOR相较于激素、JAK抑制剂或Src抑制剂更适合于防治CRS。雷帕霉素是最早批准上市的mTOR抑制剂,除直接抗肿瘤细胞杀伤能力外,也可抑制T细胞和B细胞活化,可能对CAR-T存在一定抑制作用,因此Huye等[24]设计了对雷帕霉素不敏感的CD19 CAR-T,发现和雷帕霉素联用可在体外提高杀伤淋巴瘤和急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)肿瘤细胞。此外,中国科学技术大学魏海明团队报道CAR-T活化过程中mTOR信号还可下调CXCR4的表达,导致CAR-T迁移能力受损,使用雷帕霉素预处理CAR-T,可增强CAR-T的骨髓迁移能力,增强治疗效果[25]。综上所述,mTOR抑制剂和CAR-T联用可有效干预CRS反应和增强CAR-T抗肿瘤的能力。

二、免疫检查点抑制剂

免疫检查点是指免疫系统中存在的抑制性信号通路,即所谓的“刹车”系统,以保护机体免受自身免疫反应的损害和过度的炎症反应。但肿瘤细胞可通过上调T细胞表面的免疫检查点表达以抑制T细胞的活性和杀伤作用,进而发生免疫逃逸。美国国家癌症研究所将免疫检查点抑制剂定义为对“检查点”的蛋白质具有阻断效应的药物。当检查点如PD-1、PD-L1、CTLA-4等被阻断时,T细胞可更有效的发挥杀伤作用。虽然CAR-T不受主要组织相容性复合体限制,增强了CAR-T抗肿瘤逃逸的能力,但在肿瘤抑制性免疫微环境中,免疫检查点的过表达仍可限制CAR-T发挥正常的杀伤能力。当CAR-T受到持续性的肿瘤抗原刺激时,CTLA-4、PD-1及TIM-3等免疫检查点分子过表达导致CAR-T耗竭,因此联合免疫检查点抑制剂成为提高CAR-T治疗抗肿瘤能力的新选择。目前主要研究的免疫检查点包括PD-1、CTLA-4、TIM-3等。

PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞和NK细胞,与其配体PD-L1结合后,可抑制T细胞活化和增殖。在肿瘤抗原持续性的刺激下,CAR-T过表达PD-1从而发生耗竭导致CAR-T治疗失败。2013年,John等[22]首次将PD-1抗体和靶向人类表皮生长因子受体2的CAR-T在小鼠乳腺癌肿瘤模型中联合使用发现可显著提高CAR-T内IFN-γ分泌,且PD-1抗体的联合使用降低了肿瘤微环境中髓系来源的抑制性细胞(MDSC)的比例,延长了小鼠的生存率,在靶向间皮素(msothelin)的CAR-T和癌胚抗原的CAR-T均证实有同样的效应。Cherkassky等[26]在2016年报道当肿瘤负荷过大时,mesothelin CAR-T出现耗竭,而使用PD-1抑制剂可重新激活CAR-T进而发挥抗肿瘤能力。随后Adusumilli团队报告了mesothelinCAR-T和PD-1单抗联合治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)的Ⅰ期临床试验研究数据,在接受联合治疗的MPM患者中,中位生存期为23.9个月,1年生存率高达83%,39%患者CAR-T存在时间超过100天,显著高于其他研究。同时患者在接受CAR-T及PD-1单抗后出现新的IgG应答,说明患者体内的内源性T细胞发生了激活[27],目前该治疗策略的Ⅱ期临床试验也正在开展中。Chong等[28]在2017年报道1例难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤经CD19 CAR-T治疗无效后使用PD-1单抗获得缓解,同时在使用PD-1单抗后,发现CAR-T的增殖活性显著提高并具有显著抗肿瘤反应;随后其开展了相应的临床试验,入组了12例接受过CD19 CAR-T治疗后复发难治性B细胞淋巴瘤患者,10例患者在接受PD-1单抗后外周血CAR-T重新扩增,有疗效的患者在PD-1单抗给药后,CAR-T的活化和增殖上调,耗竭程度降低。除将PD-1抗体和CAR-T进行直接组合治疗外,Fang等[29]尝试开发了可持续分泌PD-1抗体的CAR-T,用非病毒载体的piggyBac转座子系统构建两个重组质粒分别编码PD-1和嵌合抗原受体然后共转染T细胞,使靶向mesothelin的CAR-T可正常分泌抗PD-1抗体并成功治疗1例患有晚期卵巢浆液性腺癌的患者,在其体内的CAR-T不仅实现了自我扩增,且可持续分泌PD-1抗体,仅出现了高血压1级和乏力等轻微的不良反应。我中心曾成功使用治疗PD-1敲减的CLL-CAR-T治疗2例移植后复发且CD38 CAR-T治疗无效的AML患者,回输后第28天评估达到分子学CR,治疗过程仅发生1～2级CRS[30]。综上,PD-1抑制剂联合CAR-T治疗可有效改善CAR-T耗竭,增强T细胞的杀伤和增殖及细胞因子的分泌,减少免疫抑制性细胞MDSC等改善免疫抑制性微环境,从而增强CAR-T疗效。

除PD-1外,免疫检查点通路CTLA-4、TIM-3、LAG-3等均会影响CAR-T的功能,但目前上述免疫检查点与CAR-T的联合研究尚处于体内外实验阶段,临床试验报道少见。Liu等[31]报道PD-1或TIM-3敲减的CAR-T在体内外显示出更强的抗肿瘤效应。Kenderian等[18]同样证实用肿瘤抗原刺激CAR-T 1周后,PD-1和TIM-3均上调,而抑制TIM-3和PD-1后,CAR-T分泌的细胞因子增加。Condomines等[32]利用RNA干扰技术下调CTLA-4在CD19 CAR-T上的表达,使其在体内扩增及抗肿瘤的能力均增强。

三、其他单克隆抗体药物

贝林妥欧双抗是首个CD19/CD3双特异性抗体,可同时靶向结合患者恶性增殖B细胞表面的CD19,同时特异性结合T细胞表面的CD3,主要运用于儿童复发难治性B-ALL治疗。2023年欧洲血液学会(EHA)会议上北京高博医院童春容团队报告了一项CAR-T治疗无效或复发的B-ALL患者中观察贝林妥欧单抗挽救治疗疗效的研究,回顾性分析了10例CAR-T治疗失败患者接受贝林妥单抗治疗,7例患者全部达到流式细胞术(FCM)-MRD阴性,证明作为挽救治疗贝林妥欧单抗仍可使大多数CAR-T治疗失败的患者再次获得缓解的机会。

CD20是大多数B细胞从前B细胞阶段开始表达的分化抗原,为B细胞肿瘤的特异性靶点,利妥昔单抗(CD20单抗)是全球第一个应用于肿瘤治疗的靶向性单抗类药物,首先应用于治疗非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。既往临床前研究已提示,利妥昔单抗可增强CD19 CAR-T功能,发挥协同抗肿瘤作用,2022 EHA中,Ⅱ期多中心单臂设计的ZUMA-14研究数据呈现了CD19 CAR-T联合利妥昔单抗用于R/R LBCL三线及以上治疗的疗效和安全性,两者联合治疗的客观缓解率高达88%,CR率达65%,较ZUMA-1研究中单用CD19 CAR-T的CR率(58%)明显提升且并未增加不良反应[33]。我中心也开展了利妥昔单抗联合CAR-T治疗多线治疗失败的复发难治性B-ALL患者的临床研究,共入组10例CD20高表达患者,CAR-T治疗前给于利妥昔单抗治疗,对照组为10例未接受利妥昔单抗治疗患者,两组基线资料一致,随访时间分别为29.27个月和9.23个月,利妥昔单抗组患者总生存率及无白血病生存率均显著高于对照组(90%比26.7%,P=0.034;41.7%比25%,P=0.14),同时我们在体外证实利妥昔单抗预处理肿瘤细胞能有效提高CAR-T杀伤活性,并且有效降低CAR-T的耗竭(未发表)。

四、总结

CAR-T治疗是目前血液肿瘤乃至实体瘤和自身免疫疾病等最具潜力的治疗方式,显著改变了肿瘤免疫治疗的格局。但其治疗效果仍受到诸多限制,如不良反应严重、抗原逃逸、治疗持续性、异质性、复发和免疫抑制性微环境等,特别是在实体瘤中治疗效果有限等,通过设计上的不断优化及寻找可协同增效CAR-T疗效的联合治疗是克服CAR-T自身缺陷的有效策略,除与靶向治疗药物联用等,联合化疗放疗、造血干细胞移植、溶瘤病毒、肿瘤疫苗等都是未来联合治疗探索的方向。然而目前关于联合疗法的临床数据仍有限,还需要更大规模的临床试验来与单一疗法进行比较。诸多联合疗法发挥作用的机制也需进一步探究,探索更加合理的组合方案和最佳治疗时机及剂量是未来研究的主要方向。