结肠腺瘤性息肉病患者的家系调查及APC预测性基因检测研究*

方瑞华，汪昭明，邱小倩，祝玮晔，葛赛，王成龙,6，邱耕，高显华，徐晓东，邢俊杰，王颢，张卫，于恩达△，赵子夜△

1 上海长海医院肛肠外科/遗传性结直肠癌筛查防治中心 上海 200433

2 上海长海医院消毒供应科 上海 200433

3 上海长海医院口腔科 上海 200433

4 上海长海医院眼科 上海 200433

5 北京肿瘤医院消化内科暨北京市肿瘤防治研究所消化肿瘤内科 北京 100142

6 解放军第73集团军医院消化内科 福建厦门 361003

7 上海鉴研生物技术有限公司 上海 201400

结肠腺瘤性息肉病（colonic adenomatous polyposis，CAP）或称家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP），是最常见的遗传性息肉病型结直肠癌综合征[1]，其临床特征可归纳为数十枚至上千枚不等的结肠腺瘤性息肉伴或不伴有多种结肠外表现，以及显著增加的结直肠癌发生风险。现已明确，该临床综合征实际包含由多种致病基因导致的不同单基因遗传病[2]。检索孟德尔遗传病在线数据库（OMIM）可发现，FAP 1～4型被分别定义为由APC、MutYH、NTHL1、MSH3基因变异导致的四种不同的遗传综合征，其中由APC基因变异导致的FAP 1型（OMIM175100）是临床医师最为熟悉的类型。

遗传性疾病多有家族史，但受到认识不足和条件限制的影响，家系调查的开展状况尚不理想。北欧诸国在FAP 患者群体中开展的大规模调查肯定了家系调查和早诊早治的价值[3-4]，也增强了我们在国内积极开展此项工作的信心。尤为值得注意的是，当家系变异得以明确之后，尚未发病的家系风险成员即可通过基因检测验证是否携带家系变异（即预测性基因检测）从而明确其是否存在发病风险，为进一步提早确定监测对象提供了可能。鉴于上述工作尚未在国内广泛开展，笔者前期开展了关于CAP患者对基因检测态度及其影响因素的横断面调查，在对比欧美同类研究的基础上初步明确了我国CAP患病群体的特点[5-7]。在前述研究的基础上，本研究意在通过报告笔者所在研究团队在预测性基因检测方面的经验，填补国内此项实践数据的空白。

1 病例与方法

1.1 研究支持

上海长海医院遗传性结直肠癌筛查防治中心（以下简称“本中心”）由肛肠外科、消化内科、病理科、生殖医学中心等专业科室共同组成，负责进行遗传性结直肠癌的家系调查等工作。以本中心为依托，系统性梳理、登记患者及其家系信息，并最终确定符合本研究要求的CAP 家系。本研究所涉及内容均获得上海长海医院伦理委员会批准。

1.2 病例筛选

此项横断面调查数据筛选截止时间为2023 年7月31 日。研究者通过检索本中心数据，确定具有明确APC基因致病变异的先证者作为调查对象。此类患者的遗传学诊断称为FAP 1 型或APC相关息肉病（APC-associated polyposis，AAP）。

预测性基因检测对象必须为AAP 患者的无症状亲属。研究者关注的相关症状包括慢性腹泻、便血和结肠外表现（胃—十二指肠息肉、甲状腺癌、骨瘤、硬纤维瘤、肝母细胞瘤等）。这些受检者未接受过结肠镜检查，因此尚不清楚是否患有CAP。同时，结合预测性基因检测的临床指导意义，本研究进一步限定预测性基因检测对象为家系先证者的平辈或晚辈亲属。

1.3 研究流程

本研究部分工作基于本中心前期开展的CAP 患者遗传咨询及基因检测意愿调查[7]。参与前期研究的CAP患者均通过微信手机应用（weixin.qq.com，深圳腾讯科技有限公司）完成了电子问卷，有效完成问卷的部分受访者接受了本中心提供的APC基因检测，检测标本为外周血白细胞或口腔黏膜标本，检测方法为Sanger 测序，由上海迈浦生物技术公司完成。同时，既往在上海长海医院接受治疗并保存有生物标本的部分患者也纳入了此次检测范围，检测标本为手术标本中的非肿瘤组织，检测方法为高通量测序结合Sanger 测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。此外，上述检测中未发现APC基因致病变异的受检者进一步接受了多重连锁探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） 分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；另有部分受检者的家系变异于院外检测发现。根据上述检测过程，最终将在本中心登记信息的CAP 患者区分为三个亚群体，分别是AAP、非APC相关的已知息肉病综合征（如，MutYH相关息肉病[8]、BMPR1A相关息肉病[9]等）和致病基因不明的未分类的CAP。

先证者无症状亲属的预测性基因检测方法为Sanger 测序（如图1），检测标本为外周血白细胞或口腔黏膜标本，均由上海鉴研生物技术有限公司完成。实验细节详见既往报道[10]。

图1 AAP家系预测性基因检测的APC基因变异峰图

1.4 指标分析

本研究核心指标为预测性基因检测的变异检出率，即接受预测性基因检测的受检者总体携带家系变异的比例。进一步通过设定不同的受检年龄上限分别计算得出变异检出率，并以此分析检出率的变化趋势，重点关注7 岁、14 岁、18 岁这三个关键年龄节点的变异检出率和仅针对晚辈受检者的变异检出率，以探讨开展预测性基因检测的恰当时机。

1.5 统计学分析

使用SPSS 25.0 进行数据统计分析。计量资料以M（QL，QU）表示，计数资料以（n）表示。

2 结果

2.1 一般资料及先证者临床信息

整理统计本中心CAP 患者的登记信息，确认CAP先证者共450名，其中于本院就诊者289名、通过网络咨询者161名。上述先证者中，经过本中心基因检测或院外自主检测发现APC基因致病变异从而明确为AAP 的先证者共232 名。研究者通过面对面访谈或网络问卷调查向上述先证者介绍预测性基因检测的含义并征求先证者本人意见，最终有65 名家系先证者及130名来自这些家系的平辈或晚辈血缘亲属同意进行预测性基因检测并签署知情同意书（电子版）。本研究筛选受检者的流程如图2。

图2 筛选受检者流程图

先证者中位年龄为39（32，47）岁，其中男性26 名（40%）；36 名（55.4%）有家族史。先证者中3 名未婚育、1 名已婚未育，其余61 名均已婚育。CAP 表型方面，除7 名无法提供完整的结肠镜检查资料以供评估外，经典型和衰减型分别为47名和11 名；共有18 名发生癌变；在结肠外肿瘤方面，5 名罹患十二指肠腺瘤（其中1 名为腺癌），2名罹患甲状腺肿瘤（其中1 名为腺癌）；7 名罹患腹腔或腹膜后硬纤维瘤；另有部分患者被检查出先天性视网膜色素上皮肥大、骨瘤或异位骨化、小肠腺瘤、胃腺瘤等AAP 相关结肠外表现（如图3、图4）。

图3 AAP患者眼底照相检查所见

图4 AAP患者口腔锥形束投照CT检查所见

2.2 预测性基因检测的相关信息及变异检出率

65名先证者共携带49种APC基因胚系变异，其中5种变异重复出现在16名不相关的先证者中（c.637C＞T，c.694C＞T，c.3183_3187delACAAA，c.3202_3205del-TCAA，c.3927_3931delAAAGA）（表1）。上述变异中有13种未见于既往报道，为新发现的变异，包括1种错义变异（c.6338G＞A），1种剪接位点变异（c.532-1G＞C），3种无义变异（c.784insT、2861T＞G、c.3817A＞T），3 种插入—移码变异（c.1394insG、c.2670insT、c.3485insT）和5 种缺失—移码变异（c.1201delA、c.1929_1930delCA、c.2666_2667delAA、c3512delG、c.3998_3999delAA）。APC编码区域的无义变异、移码变异是致病变异的极强证据（PVS1），根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）标准[11]可判定为致病变异。错义变异和剪接位点变异在综合人群（不可用）、计算机预测（相同氨基酸改变已被证实为致病变异/PS1）、功能学（不可用）、分离（与MAP表型共分离/PP1）、新发变异（不可用）、其他信息（患者表型高度特异/PP4）等数据分析后判定为可能致病变异（1PS+2PP）。

表1 先证者所携带的APC基因胚系变异

接受预测性基因检测的130名亲属的中位年龄为12（6，24）岁，其中男性61 名，占46.9%。预测性基因检测结果显示携带家系致病变异者为52 名，占40%。限定受检者年龄上限进行分析，以50 岁为整体的年龄上限，每5岁作为一档，变异检出率分别为53.8%、48.2%、52.1%、50.6%、47.6%、44.2%、43.0%、41.6%、40.9%、40.3%，随着受检者年龄上限的降低，变异检出率逐渐趋近50%（如图5）。7岁、14 岁、18 岁这三个重要年龄节点的变异检出率分别为52.6%、52.1%、48.8%。将受检者限定为先证者的晚辈，则变异检出率为44.1%（52/118）。

图5 预测性基因检测的变异检出率随受检者年龄改变的变化

3 讨论

FAP 1型/AAP（OMIM175100）是一种常染色体显性肿瘤综合征，由抑癌基因APC的胚系杂合致病性变异引起[1]。既往报道的FAP多由各种致病基因不同但临床表型类似的息肉病综合征混合组成，总的人群患病率预计为（2～3）/10万[12-14]。Cuthbert Dukes医生于1924年在英国圣马克医院（St Mark’s Hospital）建立了世界上最早的息肉病注册中心，开启了将家系调查方法应用于CAP防控的先河。目前，欧美发达国家已经普遍建立了息肉病注册中心以开展有效的疾病防控。随着关于CAP发病的分子机制不断被阐明，诸如APC基因变异检测的遗传学检测方法开始服务于CAP的诊断和治疗[15]。虽然我国在该领域的临床实践开展较晚且不具备普遍性，但是得益于近十年来的经济发展和技术进步，家系调查开展情况和基因检测可及性均已大为改观。笔者所在研究团队近年在CAP的临床诊疗、基因检测[16]及辅助生殖技术[17]等方面均进行了积极的探索。

本中心是在上海长海医院近四十年的CAP 诊疗经验的基础上整合成立的[18-20]，意在建立跨区域的综合性服务体系从而为遗传性结直肠癌患者及其家系提供全方位的医疗服务。与此同时，针对CAP 患者的系统性调查得以基于本中心资源开展。前期开展的CAP患者基因检测意愿调查发现，80.9%的CAP患者已经接受或计划接受基因检测，且有61.3%的育有子女的CAP 患者已经让子女或计划让子女接受基因检测，因对结果恐惧而不愿让子女接受预测性基因检测则是阻碍检测的最主要原因（33.3%）[7]。由此可见，CAP 患者接受预测性基因检测的意愿较高，但仍会因为对检测意义和影响的认识不足而不能决定是否进行检测。笔者强调，把人文关怀渗透到家系调查和预测性基因检测的过程中非常重要，临床医师和遗传咨询师需要结合患者的实际情况（种族、宗教信仰、职业、风俗习惯、经济状况、家庭关系等因素）为其提供必要的解释。

如何确定进行预测性基因检测的年龄是一个重要的问题，临床医师和遗传咨询师需要结合患者的实际情况和变异检出率的客观数据进行综合考虑。Levine 等[21]的研究调查了作为父母的28 名患者对预测性基因检测的态度，总体上来说与我们的研究结果类似，但该研究的参与者的子女年龄均在10 岁以上，调查结果中并未体现出参与者对检测结果的担忧，而这恰恰是我们的研究反映的主要问题。Kattentidt-Mouravieva 等[22]对13 名年龄低于10 岁的儿童进行了FAP相关的基因检测，并对相应的8位母亲或父亲进行了调查，结果并未发现预测性基因检测对受检者父母造成心理上或身体上的不利影响。来自St Mark’s Hospital的调查研究结果显示93.5%（58/62）的受访者选择在子女出生时即进行预测性基因检测，而在告知子女检测结果的时间方面，67.3%（35/52） 的受访者选择在子女10～12 岁时告知，26.9%（14/52）的受访者选择在子女13 岁或更年长时告知[23]。在为数不多的预测性基因检测实践结果中，Johns Hopkins 大学的检测研究包含4 个家系的17 名风险亲属，平均年龄为18.6 岁，变异检出占比为6/17[24]。相较于既往研究，本研究得益于较大的样本量，检测结果具有较好的稳定性，由此认为参考价值相对较大；此外，25 岁及以下受检群体的变异检出率已接近50%，表明无症状风险亲属在这一年龄范围内接受预测性基因检测的结果预期是稳定的，这极大地纠正了样本量不足时信息偏倚而形成的错误观念。上述信息可为确定预测性基因检测的时机提供具有较高价值的参考依据。

既往有观点认为可以通过检查CAP 结肠外表现以早期确定疾病的存在，比如进行眼底检查或口腔影像学检查，检查方法无创且简便，但实践中存在至少两方面的限制性：（1）结肠外表现的外显率并非100%，难以通过检查结肠外表现的存在与否排除受检者罹患CAP 的可能性；（2）结肠外表现的识别具有专业性要求，设备的检测性能、使用方法及检查医师识别表型的经验均会影响检查结果的判断。综合来看，笔者建议此类方法仅用于家系变异未明且不适合进行结肠镜检查的受检者。

本研究的主要不足之处有以下两点：（1）家系先证者临床表型信息存在缺失现象，目前仅能部分确定其CAP 表型，至于上消化道表型及结肠外表型信息均存在明显的缺失，这阻碍了对其进行表型与基因型、环境因素的相关性分析；（2）预测性基因检测对象的临床随访信息存在缺失现象，目前仅有6名先证者亲属在预测性基因检测后进行结肠镜检查明确发病，其中3名加入了本中心“CAP内镜强化治疗计划”并接受密切的结肠镜治疗和随访，其他检测结果显示携带家系变异的受检者尚未接受结肠镜检查或在本中心进行后续信息补充。这一问题也是笔者所在研究团队关注的重点问题，随着随访信息的进一步收集与完善，我们期待获得类似北欧同行的研究实践结果，从而进一步肯定早诊早治对CAP家系的重要意义，并探索“内镜强化治疗”是否能够实现CAP 患者的去手术治疗和延迟手术的安全时间界限。

结合本研究结果认为，对于致病变异明确的CAP 家系来说，预测性基因检测能够实现致病变异携带者的早期确认从而实现早诊早治。预测性基因检测的变异检出率整体上呈现出随着受检者年龄降低而增加的趋势，受检者年龄在25 岁及以下时的变异检出率已接近50%，这些数据结果有助于临床医师和受检者亲属客观、理性地看待和理解预测性基因检测的临床价值，从而确定是否需要进行预测性基因检测及受检年龄。

利益冲突声明全体作者均声明不存在与本文相关的利益冲突。