不同产地林下药材三叶青品质差异比较

陈黎明，徐帆，柳新红，夏鹏国，梁宗锁

(1. 汉中市食品药品检验检测中心，陕西 汉中 723000；2. 浙江理工大学 生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省林业技术推广总站，浙江 杭州 310020）

三叶青Tetrastigmahemsleyanum为葡萄科Vitaceae崖爬藤属Tetrastigma植物，是我国民间一种珍稀中草药，主要分布于浙江、福建、广西、贵州等产地。现代研究表明三叶青无毒无害，能够调节机体免疫，且对肺癌、肝癌、消化系统肿瘤、流感病毒等多种疾病具有强效药理作用，在《浙江省中药饮片炮制规范》（2015 年版）已收载三叶青[1]。

三叶青一般以扦插繁殖为主，也有以块根繁殖，种植3 年后，每年的冬至—惊蛰期间（休眠期）采摘的块根，质量最好[2]。不同产地三叶青中的有效成分含量会因产地环境、生态因子、氮素水平等不同而具有较大的差异。当前，三叶青未在《中国药典》的名录内，并无统一的质量评价标准，药材质量良莠不齐。因此，本文对不同产地三叶青依据《中国药典》的规定进行水分、醇溶性浸出物含量等的测定，按照《浙江省中药饮片炮制规范》（2015 年版）的要求评价质量高低，并且利用HPLC 技术检测三叶青中有效成分的含量，以期找出质量上乘的三叶青种质资源，为三叶青产业的发展提供参考。

2 材料与方法

2.1 试验仪器与试剂

研究所用主要仪器有高速中药粉碎机、冷冻离心机和远红外快速干燥箱等，具体信息见表1。

表1 主要仪器Tab. 1 Main instruments

主要试剂：色谱级甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）；色谱级乙腈和甲醇（德国默克公司）。虎杖苷对照品、紫云英苷对照品、白藜芦醇对照品、槲皮素对照品和山柰酚对照品（均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）。乙醇（无水）、甲醇等试剂均为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）。其余生理试剂购于杭州科德诺生物技术有限公司。

2.2 试验材料

2019 年7 月，分别在浙江省温岭市、福建省沙县和宁化县、贵州省天柱县、广西壮族自治区南丹县采集三叶青块根样本。共采集了5 批，每批随机采集20 株。样本信息与种植来源见表2。

表2 三叶青样品信息Tab. 2 Sample information of T. hemsleyanum

2.3 三叶青药材处理

取5 个不同产地三叶青的新鲜块根样本，舍弃须根后用去离子水洗净沥干后，将块根切片，于55 °C 红外烘干，用高速中药粉碎机粉碎，过60 目筛。4 °C 保存备用。

2.4 三叶青中的水分测定和化学成分测定

2.4.1 水分含量测定 采用《中国药典》（2015 年版）中的水分测定法和烘干法。称取三叶青粉末2 ～ 5 g，于称量瓶中平铺，厚度不超过5 mm，称定，开启瓶盖在100 ～ 105 °C 干燥5 h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30 min，称定，再在上述温度下干燥1 h，放冷，称量，至连续两次称量的差异不超过5.00 mg 为止，根据减失的质量，计算三叶青样的含水量（%）[3]。

水分含量（%）= [样本质量－（烘干后总质量－称量瓶质量）] /样本质量×100 %

2.4.2 浸出物含量测定 采用《中国药典》（2015 年版）中的醇溶性浸出物测定法。精密称取三叶青样本约2.00 g，称定质量（准确至0.01 g），置锥形瓶中，溶剂为70%乙醇，以干燥品计算三叶青样本中醇溶性浸出物的含量（%）[4]。浸出物含量（%）= [ 样本质量－（烘干后总质量－蒸发皿质量）] / 样本质量 ×100 %

2.4.3 总黄酮含量测定 总黄酮的测定采用王萍等[5]的方法，使用硝酸铝-亚硝酸钠比色法稍加修改。

（1）试剂的配置。①配置5%亚硝酸钠溶液：准确称取5.00 g 亚硝酸钠，加入去离子水溶解并定容至100 mL容量瓶中；②配置10%硝酸铝溶液：准确称取20.00 g 硝酸铝九水合物固体，加入93.6 mL 去离子水溶解；③配置4 %氢氧化钠溶液：精确称取10.00 g 氢氧化钠固体，用去离子水溶解并定容至250 mL；④配置芦丁标准液0.02 mg·mL-1：准确称取1.09 mg 芦丁对照品，加入适量70%乙醇溶解，并用去离子水定容至50 mL 容量瓶，混匀，得标准溶液浓度为0.218 mg·mL-1。保存于4 °C 冰箱中，备用。

（2）标准曲线的绘制。分别精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 芦丁标准液对照品溶液于10 mL容量瓶中，加70%乙醇至4 mL，再精密加入0.40 mL 的5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min；精密加0.40 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；精密加4.00 mL 的4%氢氧化钠溶液，最后加乙醇定容，摇匀，静置15 min，使反应完全后在510 nm 波长处测定吸光度（A）[6]。

求得标准曲线的回归方程为y= 0.011 10x+ 0.002 267，R2= 0.999 7，如图1。式中，x为浓度，y为吸光度。

图1 芦丁标准曲线Fig. 1 Standard curve of rutin

2.4.4 总酚含量测定 总酚含量测定采用张萍等[7]的方法，即采用福林酚比色法（Folin ciocalteu），并稍加修改。

（1）试剂的配制。配置16%碳酸钠溶液：精确称取16.00 g 碳酸钠固体，用去离子水溶解定容至100 mL 容量瓶中。配置0.10 mg·mL-1没食子酸标准液：准确称取10.00 mg 没食子酸（gallic acid）对照品，加适量无水乙醇溶解，并用去离子水定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，得浓度为0.10 mg·mL-1标准溶液。保存于4 °C 冰箱中，备用。

（2）标准曲线的绘制。分别精密移取0、25、50、75、100、125、150 μL 没食子酸标准母液于5 mL 容量瓶中，依次加入适量去离子水摇匀，200 μL 福林酚试剂混合，充分振荡后于室温下反应10 min 后加入16%碳酸钠溶液600 μL，得到没食子酸标准溶液浓度为 0.5 ～ 3 mg·mL-1的系列对照品溶液。摇匀后在室温下放置，避光反应1.5 h。经福林试剂显色后于762 nm 波长处测定吸光度（A）。

求得标准曲线的回归方程为y= 0.104 2x－0.005 600，R2= 0.998 9，如图2。式中x为浓度，y为吸光度。

图2 没食子酸标准曲线Fig. 2 Standard curve of gallic acid

2.5 HPLC 检测

2.5.1 样品的制备 标准品溶液的制备：精密称取虎杖苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素和山柰酚对照品，加入色谱级甲醇配置成1.00 mg·mL-1的混合标准品溶液，备用。每个样品设置三个重复。

三叶青提取液的制备：称取5 个产地三叶青块根粉末各1.00 g，加入80%甲醇10 mL 称定，超声30 min（50 °C，功率200 W），冷却，用80%甲醇补足失重。8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，重复提取两次，合并两次上清液，定容至10 mL，即得浓度为0.10 g·mL-1的三叶青提取液，待测[8]。每个样品设置三个重复。

2.5.2 HPLC 测定有效成分含量 HPLC 测定方法参考王静的测定方法，测定5 个三叶青样品中的有效成分含量。

色谱条件：采用Sunfire C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0 ～ 20 min，5% ～ 15% A；20 ～ 60 min，15% ～ 30% A；60 ～ 85 min，30% ～ 100% A；90 ～ 100 min，5% A），流速0.8 mL·min-1，柱温30 °C，进样量20 μL，检测波长210 ～ 400 nm[9]。

混合标准品溶液的色谱图见图3。1、2、3、4、5 色谱峰分别为虎杖苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素和山柰酚。

图3 标准品HPLC 指纹图谱Fig. 3 HPLC fingerprint of standard

标准曲线的绘制：以标准品浓度（μg·mL-1）为横坐标，对应峰面积（mAU）为纵坐标绘制标准曲线（见图4），其线性方程如下。

图4 三叶青中有效成分标准品的标准曲线Fig. 4 Standard curve of the standard substance of active ingredients in T. hemsleyanum

虎杖苷：y= 132 555x－11 329，R2= 0.999 9；

紫云英苷：y= 48 072x－1 116.8，R2= 0.999 9；

白藜芦醇：y= 242 503x－15 429，R2= 0.999 9；

槲皮素：y= 42 260x+ 15 241，R2= 0.999 1；

山柰酚：y= 69 014x－13 370，R2= 0.999 9。

三叶青块根中虎杖苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素和山柰酚的含量均在 0.5 ～ 50 μg·mL-1范围内呈现线性关系。

2.6 数据统计分析

所有数据均采用Excel 软件进行统计，用SPSS 26.0 软件进行分析。图形的绘制使用GraphPad Prism 8 软件。

3 结果与分析

3.1 不同产地三叶青中的水分和浸出物含量比较

将来自不同产地的5个三叶青样本按照2.4节方法进行测定及计算，得到5个产地三叶青的水分含量（表3）。5 个不同产地三叶青的水分含量范围在5.97% ～ 11.01%。其中以GX-ND 的水分含量最高，平均含量为11.01%，水分含量最低的为FJ-SX，平均含量仅为5.97%。

表3 不同产地三叶青水分与浸出物含量比较Tab. 3 Water and extract content of T. hemsleyanum from different producing areas

将来自不同产地的5 个样本按照2.4 节方法进行测定及计算，得到5 个产地的醇溶性浸出物含量（表3）。5 个不同产地三叶青的浸出物含量范围在9.24% ～ 18.82%，根据《浙江省中药饮片炮制规范》（2015 年版）规定[1]，均符合要求（即9%）。但不同产地三叶青的浸出物含量存在较大差异。其中ZJ-WL 的浸出物含量最高，为18.82%，GX-ND 的浸出物平均含量最低，仅为9.24%。

3.2 不同产地三叶青总黄酮和总酚含量比较

由图5 可知，不同产地三叶青的总黄酮含量在78.94 ～ 123.84 mg·g-1DW，且不同产地的三叶青的总黄酮含量存在显著差异（P<0.05）。其中，ZJ-WL 的总黄酮含量显著高于其他4 个产地三叶青的总黄酮含量（P<0.05），ZJ-WL 的总黄酮含量显著高于FJ-NH、FJ-SX 和GX-ND（P<0.05），FJ-NH、FJ-SX 和GX-ND 的总黄酮含量没有显著差异。5 个产地三叶青中，ZJ-WL 的总黄酮含量最高，达到123.84 mg·g-1DW；其次为GZ-TZ，其总黄酮含量为105.40 mg·g-1DW；而FJ-NH 和 FJ-SX 的总黄酮含量分别为81.12 mg·g-1DW 和78.94 mg·g-1DW，与GX-ND 的总黄酮含量 79.21 mg·g-1DW 较为接近。

图5 不同产地三叶青总黄酮和总酚含量比较Fig. 5 The content of total flavonoids and phenols in T. hemsleyanum from different producing areas

从图5 还可看出，不同产地三叶青总酚含量在6.89 ～ 51.03 mg·g-1DW，不同产地的三叶青的总酚含量差异显著（P<0.05）。其中，FJ-SX 和ZJ-WL 的总酚含量无显著差异，但显著高于其他3 产地三叶青的总酚含量（P<0.05），GZ-TZ 和FJ-NH 的总酚含量无显著差异，但与GX-ND 的总酚含量存在显著差异（P<0.05）。5 个产地三叶青中， FJ-SX 的总酚含量最高，达到51.03 mg·g-1DW；其次为ZJ-WL，其总酚含量为48.53 mg·g-1DW；GZ-TZ 和FJ-NH 的总酚含量分别为40.26 和40.11 mg·g-1DW；GX-ND 的总酚含量最低，仅为34.08 mg·g-1DW。

3.3 不同产地三叶青的有效成分含量比较

将5 个产地的三叶青进行HPLC 检测，对其中的虎杖苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素和山柰酚5 种有效成分含量进行分析比较，结果如图6。由图6 可知，不同产地三叶青的虎杖苷、紫云英苷、白藜芦醇、槲皮素和山柰酚含量均存在显著差异（P<0.05）。

图6 不同产地三叶青有效成分含量比较Fig. 6 The content of effective ingredients in T. hemsleyanum from different producing areas

虎杖苷在FJ-SX 中含量最高，达到32.41 mg·kg-1DW；其次是ZJ-WL，含量为21.57 mg·kg-1DW；再次为GZ-TZ，含量为9.45 mg·kg-1DW；在GX-ND 和FJ-NH 中的含量较低，分别为4.53、3.08 mg·kg-1DW。紫云英苷在GZ-TZ 中含量最高，达55.84 mg·kg-1DW；其次是GX-ND 和ZJ-WL，含量分别为14.43、12.70 mg·kg-1DW；在FJ-SX、FJ-NH 中均未检测出。白藜芦醇含量在FJ-SX 中含量最高，达29.58 mg·kg-1DW；其次为GZ-TZ，含量为22.53 mg·kg-1DW；而在FJ-NH、GX-ND 和ZJ-WL 中的含量较低，分别为6.63、4.06 和2.63 mg·kg-1DW，且与前两者均差异显著（P<0.05）。槲皮素在ZJ-WL 中的含量最高，为21.35 mg·kg-1DW；其次是FJ-NH，为13.75 mg·kg-1DW；在GX-ND（广西南丹）中的含量最低，仅为1.47 mg·kg-1DW。山柰酚在 ZJ-WL 中含量最高，达14.14 mg·kg-1DW；其次是FJ-SX，为5.28 mg·kg-1DW；在GZ-TZ 中的含量最低，仅为2.48 mg·kg-1DW。

3.4 三叶青各指标的相关性分析

采用SPSS 26.0 软件对不同产地三叶青的9 个指标进行相关性分析（Pearson）[10]，并绘制相关系数的矩阵表，结果见表4。

表4 三叶青各指标的相关性分析Tabl. 4 Correlation analysis of indicators of T. hemsleyanum

由表4 可知，三叶青的9 个指标呈现出不同程度的相关性。三叶青的浸出物含量与总酚、虎杖苷、槲皮素含量呈极显著正相关（P<0.01），与总黄酮、山柰酚含量呈显著正相关（P<0.05）；总黄酮含量和槲皮素、山柰酚含量呈现极显著正相关（P<0.01）；总酚含量与虎杖苷含量呈极显著正相关（P<0.01），与槲皮素、山柰酚含量呈显著正相关（P<0.05）；虎杖苷含量与白藜芦醇含量呈显著正相关（P<0.05）；槲皮素含量与山柰酚含量呈显著正相关（P<0.05）；而三叶青的水分含量和白藜芦醇含量呈极显著负相关（P<0.01）。

4 结论与讨论

4.1 讨论

按照《中国药典》（2015 年版）对5 个产地的三叶青进行常规药材检测，发现不同产地三叶青的水分含量为5.97% ～ 11.01%，平均含量为7.94%；浸出物含量为9.24% ～ 18.82%，平均含量为15.04%，均＞9%，符合《浙江省中药饮片炮制规范》（2015 年版）的要求[1]，其中浙江温岭产三叶青的浸出物含量最高，为18.82%。

本研究结果表明，5 个产地三叶青的总黄酮含量和总酚含量存在显著差异（P<0.05）。该结果与郑军献[11]、黎颖菁等[12]的研究结果相一致。总黄酮含量最高的三叶青为ZJ-WL（浙江温岭），其总黄酮含量达到123.84 mg·g-1DW。总酚含量最高的三叶青为FJ-SX（福建沙县），达到51.03 mg·g-1DW，其次为ZJ-WL（浙江温岭），其含量为48.53 mg·g-1DW。若仅考虑总黄酮和总酚含量来选择良种，浙江产三叶青ZJ-WL 较其他省份的三叶青更佳。由三叶青中有效成分含量研究结果显示：虎杖苷在FJ-SX 中含量最高，为32.41 mg·kg-1DW；紫云英苷在GZ-TZ（贵州天柱）中含量最高，为55.84 mg·kg-1DW，而在FJ-SX 和FJ-NH（福建宁化）2 个样本中未能检测出；在FJ-SX 中的白藜芦醇含量最高，为29.58 mg·kg-1DW；槲皮素在ZJ-WL 中含量最高，为21.35 mg·kg-1DW；在ZJ-WL 中的山柰酚含量最高，为14.14 mg·kg-1DW，约为其他省份三叶青中山柰酚含量的3 倍。基于总黄酮、总酚含量和5 种有效成分含量的研究结果，浙江产的三叶青样本具有较高的指标，可为今后的选种提供参考。

中药材的化学成分不同会影响其药理活性的发挥，且易受地理环境变化的影响，如产地不同其环境因子会发生变化[13]，进而影响中药材中次生代谢产物的积累。相关研究表明，不同产地三叶青在黄酮类成分[14]和酚类成分[8]的含量上存在较大差异。本文对5 个产地的三叶青的化学成分进行了含量测定和HPLC 指纹图谱研究，结果显示，不同产地的三叶青大体上具有相同的化学成分，但是有效成分的含量却具有明显差异。不同产地的地理和气候因子如海拔、降水量、气温等生态因子均会影响三叶青块根中总黄酮等物质的合成和积累[15]，同样地，不同生长年限也会影响三叶青内含物的积累。总黄酮、总酚等化学物质的含量与其生物合成相关酶的转录水平和表达量呈正相关的关系[16]。三叶青块根中有效成分的积累与相关合成酶基因的表达量密切相关，如PAL、CHS和CHI在黄酮代谢途径中起着关键性的调控作用[17]，产地不同这些关键酶活性的差异显著。

相关性分析能够发现多项指标间潜在存在的相互制约关系[18]。本研究中相关性分析结果显示：三叶青的水分、白藜芦醇含量呈显著负相关（P<0.05）；浸出物含量与总酚、虎杖苷、槲皮素含量呈极显著正相关（P<0.01）；总黄酮含量与槲皮素、山柰酚含量呈极显著正相关（P<0.01）；总酚含量与虎杖苷含量呈极显著正相关（P<0.01），与槲皮素、山柰酚含量呈显著正相关（P<0.05）；5 种有效成分之间，虎杖苷含量和白藜芦醇含量呈显著正相关（P<0.05），槲皮素与山柰酚含量呈显著正相关（P<0.05）。对不同产地三叶青不同指标进行含量的测定并分析其差异，可为三叶青的质量评价提供必要的参考依据。

4.2 结论

本文通过对来自5 个不同产地（浙江温岭、福建沙县、福建宁化、贵州天柱、广西南丹）的三叶青进行常规检测，并使用高效液相色谱法测定5 种有效成分含量，结果发现不同产地三叶青的各项指标均存在显著差异，浙江产三叶青的各项指标均位居前列。