膀胱灌注卡介苗治疗中高危非肌层浸润性膀胱癌疗效预测模型的建立

戚 宇 王 杭 郭剑明 姜 帅，2△

（1复旦大学附属中山医院泌尿外科 上海 200032； 2复旦大学附属中山医院吴淞医院泌尿外科 上海 200940）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有57.3 万新发病例，新增死亡人数约21.3万人［1］。2022 年我国预估新发膀胱癌患者约9.2 万人，预估新增死亡人数约4.3 万人［2］。膀胱癌具有多次复发的特点，极大增加了我国社会医疗体系的负担。

膀胱癌根据肿瘤浸润深度分为非肌层浸润性膀 胱 癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），75%～80% 的患者为NMIBC［3］。NMIBC 病变包括局限于黏膜（Ta，Tis）和黏膜下层（T1）的病变，指南推荐的治疗方式包括经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumour，TURBT），术后膀胱灌注治疗等［4］。根据AUA 膀胱癌复发危险分层［5］，NMIBC 可以分为低中高危3 个级别，中高危组患者TURBT 术后接受卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）膀胱灌注治疗可有效降低肿瘤复发和进展。临床实践中行卡介苗治疗的中高危NMIBC 患者中仍有20%～50%在1 年内复发进展［6］。如何筛选出合适的患者进行卡介苗膀胱灌注治疗，最大程度地使患者获益是NMIBC 患者治疗的瓶颈。本研究通过回顾性分析NMIBC 患者于TURBT 术后行卡介苗膀胱灌注治疗的相关临床数据，旨在建立中高危NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注的疗效预测模型并验证其可行性。

资 料 和 方 法

一般情况本研究为回顾性分析，收集2014 年1 月至2019 年1 月于复旦大学附属中山医院泌尿外科就诊、TURBT 术后采用卡介苗膀胱灌注治疗的268 例NMIBC 患者的相关数据。随访周期：术后2 年内每3 个月1 次，术后2～5 年每6 个月1 次，术后5 年后每年1 次，末次随访时间为2022 年1 月31 日。纳入标准：（1）病理诊断为NMIBC；（2）随访数据完整；（3）临床数据完整（包括血常规、病理类型和病理分级等）；（4）尚无证据证明患者在TURBT 之前已有淋巴结或肿瘤远处转移；（5）AUA 膀胱癌复发危险分级为中高危。最终共纳入258 例患者，筛选流程如图1 所示。所有入组患者均签署知情同意书，并于TURBT 术前行血液学指标检测。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（编号：B2021-198）。

图1 临床试验流程图Fig 1 Flow diagram of the clinical trial

通过复旦大学附属中山医院病案系统查询患者临床信息（表1），包括性别、年龄、分期、病理级别、肿瘤大小、膀胱癌初/复史、肿瘤数目、化疗灌注史、既往其他肿瘤病史、二次经尿道膀胱肿瘤切除（re-TURBT）病史和血常规指标，包括血红蛋白、血小板、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）。病理分期根据美国癌症联合会（AJCC）第7 版TNM 分期［7］。

表1 中高危NMIBC 患者的临床基线数据Tab 1 Clinical data of medium- and high-risk NMIBC patients［n（%）］

膀胱灌注卡介苗方案及不良反应取120 mg卡介苗（成都生物制品研究所有限责任公司）溶于生理盐水50 mL，患者灌注前排空膀胱，卡介苗经一次性导尿管注入膀胱，保留2 h 后排出体外，排出尿液经消毒后丢弃。术后第3 周开始卡介苗膀胱灌注疗程，共计3 年：诱导周期为6 周，每周灌注1 次，共6 次；随后每2 周膀胱灌注1 次，共3 次；以后每月1次；后续1～2 个月膀胱灌注1 次。患者术后2 年内每3 个月复查膀胱镜，术后2～5 年每6 个月复查膀胱镜，术后5 年每年复查膀胱镜。随访记录患者疗效及不良反应，采用1 年和3 年无复发生存率评估卡介苗膀胱灌注疗效。观察终点为肿瘤复发时间及患者生存时间。

欧洲泌尿外科学会将卡介苗灌注后不良反应分为局部不良反应和全身不良反应。局部不良反应有膀胱炎、有症状的肉芽肿性前列腺炎和睾丸附睾炎等；全身不良反应有乏力、发热、关节炎、持续高热（＞38.5 ℃，持续48 h 以上）等［8］。

统计学方法本队列根据随机数字分组法按照7：3 分为训练集（n=180）和验证集（n=78），两组临床基线数据差异无统计学意义（P＞0.05）。采用χ2检验，叶氏连续性校正检验（Yates’ continuity correction）以及Logrank 检验。

血常规指标采用LASSO 回归模型（R 包：glmnet）筛选独立预后因子。将预测因子与患者临床信息结合，通过单/多因素Cox 回归模型建立疗效预测模型，预测患者经卡介苗治疗后肿瘤无复发生存时间（recurrence-free survival，RFS）。每项指标的临界值采用本医院临床检验临界值进行确认：血红蛋白130 g/L，中性粒细胞6.3×109/L，嗜酸性粒细胞0.52×109/L，嗜碱性粒细胞0.06×109/L，血小板125×109/L，单核细胞0.6×109/L，淋巴细胞3.2×109/L，CRP 3.0 mg/L。

使用SPSS、GraphPad Prism 8 和R3.6.2 等软件进行统计分析。Logrank 检验、LASSO 回归分析和单多因素Cox 回归分析用于患者生存相关统计分析。采用双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

本研究共纳入258 例NMIBC 患者，中位随访时间53.0（12.0～98.2）个月，其中高龄患者（＞70 岁）96 例（37.2%），男性患者175 例（67.8%），女性患者83 例（32.2%）。根据AUA 膀胱癌复发风险分层［5］，中危患者33 例（12.8%），高危患者225 例（87.2%）。258 例患者中共有80 例（31.0%）肿瘤复发或转移，219 例（84.9%）1 年无复发生存，192 例（74.4%）3 年无复发生存，随访期间共有11 人因肿瘤进展死亡，总体生存率为95.7%。灌注期间有181 例（70.2%）出现不良反应，包括乏力5 例（1.9%）、发热101 例（39.1%）、持续高热5 例（1.9%）、尿频尿急161 例（62.4%）、血尿11 例（4.3%），对症治疗后均缓解，可耐受整个疗程。

检测患者术前血常规结果，包括血红蛋白、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、CRP 及随访患者肿瘤复发情况。训练集和验证集患者在性别、年龄、肿瘤分期、病理类型、病理分级、肿瘤大小、肿瘤数目、re-TURBT、血常规检测指标等临床数据基线上的差异均无统计学意义（表1）。

在训练集（n=180）中用LASSO 回归模型筛选血常规结果发现（图2），中性粒细胞和CRP 可作为卡介苗膀胱灌注疗效的预测因子。同时将以上两个因素和性别、年龄、分期、病理级别、肿瘤大小、膀胱癌初/复史、肿瘤数目、化疗灌注史、既往其他肿瘤病史和re-TURBT 纳入单因素Cox 回归分析（表2），结果显示高龄（P＜0.001）、卡介苗灌注前未行re-TURBT（P=0.004）、中性粒细胞高水平（P=0.001）、CRP 高水平（P＜0.001）是中高危NMIBC患者卡介苗灌注后复发的危险因素。多因素Cox 回归模型显示，NMIBC 患者经卡介苗治疗前行re-TURBT 可显著降低复发风险（HR=0.409，95%CI：0.241～0.693，P=0.001），高龄（年龄＞70 岁）患者行卡介苗灌注治疗后复发率较年轻患者更高（HR=2.040，95%CI：1.208～3.446，P=0.008），中性粒细胞增高（HR=1.827，95%CI：1.018～3.280，P=0.044）和CRP 升高（HR=2.462，95%CI：1.374～4.412，P=0.002）是NMIBC 患者卡介苗治疗后复发的高危因素（表2）。病理类型、病理分级、肿瘤大小、膀胱癌病史、肿瘤数目、化疗灌注史并不是独立预测因子（P＞0.05）。用re-TURBT、高龄、CRP 和中性粒细胞建立新的疗效预测模型Nomogram 图（图3），校准图评价模型显示，训练集中3 年和5 年RFS 均具有较高拟合度，验证集中3 年RFS 具有较高拟合度（图4）。用C-index 校验疗效预测模型的预测效能，训练集C-index 为0.744（95%CI：0.682～0.806），验证集C-index 为0.847（95%CI：0.770～0.924），表明该预测模型具有较好的预测效能。

表2 训练集NMIBC 患者行卡介苗疗效单/多因素Cox 回归分析Tab 2 Efficacy of BCG in NMIBC patients analyzed by univariate/multivariate Cox regression analysis in the training set

图2 LASSO 回归模型筛选血液学指标中预测因子Fig 2 LASSO regression model used to screen predictors of hematological indicators

图3 预测NMIBC 患者行卡介苗治疗后RFS 的Nomogram 图Fig 3 Prediction of RFS in NMIBC patients after BCG treatment by Nomogram

图4 NMIBC 患者行卡介苗治疗后RFS 预测Fig 4 Prediction of RFS in NMIBC patients after BCG treatment

根据新疗效预测模型，将NMIBC 患者划分为高风险组和低风险组，并分别在训练集、验证集和总集行K-M 生存曲线分析。在训练集和验证集中高风险组患者RFS 明显缩短（P＜0.001，图5A、5B）。总集内高风险组1 年无复发生存率为76.7%，显著低于低风险组的95.5%；总集内高风险组3 年无复发生存率显著低于低风险组（62.3%vs.90.2%，图5C）。总集内高风险组与低风险组相比，总体生存时间缩短（图5D）。因此，该疗效预测模型可以较好地对中高危NMIBC 患者行卡介苗治疗的疗效进行预测。

图5 不同风险分层的NMIBC 患者行卡介苗治疗后RFS 和OS 的K-M 曲线Fig 5 RFS and OS of NMIBC patients after BCG treatment in different risk stratifications analyzed by K-M curve

讨 论

恶性肿瘤的发生发展与患者免疫状态以及肿瘤的生物学状态息息相关，同时考虑患者身体状态及肿瘤病理信息可更准确地预测肿瘤复发及转移。NMIBC 患者占膀胱癌患者75%以上［3］，术后复发率较高，目前国际指南推荐对于TURBT 术后中高危NMIBC 患者采用膀胱灌注卡介苗治疗1～3 年，但缺乏行之有效的复发预测模型。明确卡介苗疗效，筛选适宜人群，可极大提高我国NMIBC 患者的治疗效果。一项国外研究纳入9 项随机对照试验进行Meta 分析，2 820 名NMIBC 患者行卡介苗灌注后肿瘤总体复发率为42.9%［9］，另一项临床研究显示1 年复发率达到27%［10］。本中心NMIBC 患者膀胱灌注卡介苗后总体复发率为31.0%，1 年复发率为15.1%，3 年复发率为25.6%，优于国外研究，可能是由于我国将卡介苗列入一类疫苗，在婴幼儿时期普遍接种，体内已具有一定的特异性免疫反应抗体，而国外大多未将卡介苗列入疫苗常规接种。

机器学习可以从更多复杂的预测因素中检测更为有效的临床预测因子，LASSO 回归是一种对复杂数据进行变量筛选的算法，可以简化模型的复杂性，并防止过度拟合。本研究尝试采用LASSO回归筛选血常规中多个相关因子，从血常规指标中筛选出中性粒细胞及CRP 作为预测因子，并进一步将以上指标纳入多因素回归模型中［11］，这种方法可以更准确地筛选出独立预测因子，同时构建的疗效预测模型具有理想预测效能（C-index=0.719）。

TURBT 作为NMIBC 治疗的金标准，存在首次切除不彻底、切除深度不够等不利因素，故可能低估膀胱癌恶性程度及肿瘤分期。既往研究表明，首次TURBT 术后肿瘤残余率为20%～78%［12］，re-TURBT 术后5 年RFS 较首次TURBT 明显增高（63%vs.40%）［13］，推测re-TURBT 可更完整地切除膀胱肿瘤，降低肿瘤负荷，提高膀胱灌注卡介苗的疗效，与本研究结论一致。

本研究发现高龄NMIBC 患者（＞70 岁）行卡介苗治疗后复发率较高：高龄患者细胞免疫功能较年轻人差［14］；高龄患者可能伴有一定的基础疾病，导致药物耐受性不足，不能足量足程完成卡介苗治疗。

卡介苗是牛型结核杆菌经人工培养减毒活疫苗，仍保留有一定的免疫原性。1976 年Morales 首次将卡介苗用于膀胱癌的治疗［15］。卡介苗用于膀胱癌治疗的原理尚未完全阐明，但已有研究表明其可通过诱导患者机体产生炎性反应而杀伤肿瘤细胞，包括促进巨噬细胞向M1 型极化，极化后巨噬细胞可以分泌大量促炎因子（如IL-1 和TNF-α），从而杀伤肿瘤细胞［16-17］。另外，在卡介苗灌注后不久膀胱壁及尿液中会出现中性粒细胞［18-19］，提示中性粒细胞参与早期抗肿瘤应答。研究指出，血液中中性粒细胞/淋巴细胞比值＞2.5 时，NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注治疗后复发率升高［20］，与本研究结论一致，血液中性粒细胞增高是NMIBC 患者TURBT术后行卡介苗膀胱灌注治疗后复发的高危风险因素。中性粒细胞在肿瘤发生发展中扮演着重要角色，多项研究发现中性粒细胞可发生表型和功能重塑，促进血管生成及导致肿瘤免疫抑制。中性粒细胞可以通过分泌炎症趋化因子，加剧肿瘤微环境的炎症反应，促进肿瘤细胞增殖［21］。因此，卡介苗膀胱灌注治疗前血液中性粒细胞的升高可能对肿瘤复发具有一定的预测价值。

本研究发现，当CRP 升高时（＞3.0 mg/L），NMIBC 患者接受卡介苗治疗后复发风险升高。CRP于肝脏中合成，受多种促炎因子调控，人体正常条件下其表达水平较低（≤3.0 mg/L）。已有研究表明CRP升高与多种侵袭性肿瘤相关［22］。CRP增高提示患者体内具有较高的炎症水平，由此提示高水平炎症反应是NMIBC 患者卡介苗膀胱灌注后复发的高危因素。炎症指标（如白细胞、中性粒细胞、中性粒细胞/淋巴细胞比值和CRP 等）升高被证实与多种肿瘤不良预后相关［23-25］。综上所述，通过re-TURBT、高龄、中性粒细胞及CRP 所建立的疗效预测模型具有一定的理论基础。

本研究提出将血液学指标与临床病理信息相结合建立疗效预测模型，对膀胱灌注卡介苗治疗NMIBC 具有积极的临床意义，同时临床数据简单易得。本研究属于单中心回顾性分析，可能具有一定的选择偏移和信息偏移，还需进一步大样本多中心前瞻性随机对照研究进行验证。综上所述，TURBT 术后卡介苗膀胱灌注对于中高危NMIBC患者安全有效，建立疗效预测模型可有效筛选中高危NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注的获益人群。

作者贡献声明戚宇 论文构思、撰写和修订，数据统计和分析，构建模型，绘制图表。王杭数据采集，论文修订。郭剑明 研究设计，论文构思和修订。姜帅 论文构思和修订，数据搜集和整理。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。