异烟酰胺-戊二酸-吡嗪酰胺三元共晶的太赫兹光谱和DFT计算

万 梅, 张佳乐, 方济渊, 刘建军, 洪 治, 杜 勇

中国计量大学太赫兹技术与应用研究所, 浙江 杭州 310018

引 言

药物共晶被定义为两种或两种以上组分在非共价键作用下以固定的化学计量比结合而成的晶体[1]。 在过去的几十年中, 在非共价键作用下形成的二元共晶已被广泛报道, 因为二元药物共晶的形成不仅不会影响活性药物成分(active pharmaceutical ingredients, APIs)的活性, 而且能够赋予APIs优越的理化性质[2]。 与此同时, 对三元共晶等复杂共晶的研究也越来越受到重视。 与二元共晶相比较, 三元共晶则需要更多种类的API药物分子参与共晶的形成[3-4]。 同时必须结合相应晶格内的分子排列、 形状和大小等多个空间因素进行优化, 这些问题都大大增加了合成特定三元共晶的难度, 所以三元共晶的形成既有巨大的挑战, 也有巨大的潜力[5]。 为了成功地获得三元共晶, 我们需要更好地了解药物共晶研究体系中微观分子结构的变化、 分子间相互作用力的精细平衡以及溶解性质, 更重要的是我们需要深入地了解三元共晶形成后的结构变化。 众所周知, 药物理化性质的改变源自于API与共晶形成物(cocrystal coformers, CCFs)在非共价键(氢键、 范德华力和π-π堆积作用等)作用下使得API分子结构产生微小变化, 其中影响最大的, 占最重要地位的就是氢键[6-7]。 众多氢键的连接形式提供了许多氢键合成相关的官能团, 为设计新型三元共晶提供了一个思路, 使三元共晶筛选成功几率加大[4, 8]。 所以, 三元共晶结构中氢键的连接形式越来越受到相关研究人员的关注。

异烟酰胺(iso-nicotinamide, IA)是一种二线抗结核药, 主要用于经一线药物治疗无效的案例。 IA广泛用于药物共晶, 因为其分子结构中具有氢键常见合成元吡啶N和酰胺官能团, 可与多种含羧酸的CCFs发生良好的分子间氢键相互作用[9]。 戊二酸(glutaric acid, GA)是重要的有机化工原料和中间体, 主要用作合成树脂、 合成橡胶聚合时的引发剂。 GA是比较常见的CCF, 结构简单, 有两个对称的羧基官能团。 二羧酸是常见小分子结构, 一系列的二羧酸分子被大量应用于共晶实验筛选阶段中, 涉及心脑血管疾病, 抗炎类药物, 抗糖尿病药物的药物共晶实验[10]。 吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是一种常用的一线抗结核类药, 属于世界卫生组织推荐的一种有效的结核化疗药物[11]。 它在化学结构上与IA相似, 具有氢键常见合成元吡啶N和酰胺官能团。 三种起始组分的分子结构如图1所示。 Kulla等使用粉末X射线衍射和Raman光谱等手段证明了IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的存在, 并展示了研磨条件对机理和动力学研究的影响[12]。 他们在研究这些共晶时, 发现这三种起始药物可能通过一系列不同的氢键形式形成相应的共晶。 为了理解IA-GA-PZA三元共晶结构的氢键形式, 需要通过一些检测手段去有效地分析和识别由分子间相互作用引起的细微结构变化。

图1 IA(a)、 GA(b)和PZA(c)的分子结构Fig.1 Molecular structures of IA (a), GA (b) and PZA (c)

太赫兹(Terahertz, THz)波是指频率范围在0.1～10 THz, 波长为0.03～3 mm的电磁波, 许多分子间的相互作用(如氢键)、 振动跃迁、 偶极子旋转和晶体晶格低频振动的吸收能级都位于远红外-太赫兹波段[13]。 因此, 利用太赫兹光谱技术可以准确获取被测物质的特征谱, 从而有效地分析和识别由分子间相互作用引起的细微结构变化。 此外, 密度泛函理论(density functional theory, DFT)可以模拟共晶的分子结构和光谱性质, 得到的模拟结果可以用于分子结构分析和振动模式归属[14-15]。

在本研究中, 采用机械研磨方法成功地合成了IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶, 通过THz光谱和DFT计算对IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的分子结构进行表征, 确定所有二元以及三元共晶结构中比较合理的氢键形式。 最后, 将IA-GA、 PZA-GA二元共晶的氢键合成元与IA-GA-PZA三元共晶的氢键合成元进行对比, 由此来确定二元氢键合成元对预测三元共晶氢键合成元的理论结构是否有重要的参考价值, 同时进一步深入了解实验光谱中IA-GA-PZA共晶结构中显示的氢键形式。

1 实验部分

1.1 样品制备

IA(纯度为99%), GA(纯度为99%)和PZA(纯度为99%)购自上海百灵威科技有限公司。 所有药品使用前都未经进一步纯化。

IA-GA共晶: 使用行星式球磨机在25 mL不锈钢研磨罐研磨1∶1化学计量的IA(0.02 mol, 244.25 mg)和GA(0.02 mol, 264.28 mg), 在室温下以25 Hz的频率研磨90 min。

PZA-GA共晶: 使用行星式球磨机在25 mL不锈钢研磨罐研磨1∶1化学计量的PZA(0.02 mol, 246.22 mg)和GA(0.02 mol, 264.28 mg), 在室温下以25 Hz的频率研磨90 min。

IA-GA-PZA共晶: 使用行星式球磨机在25 mL不锈钢研磨罐研磨1∶1∶1化学计量的IA(0.02 mol, 244.25 mg), GA(0.02 mol, 264.28 mg)和PZA(0.02 mol, 246.22 mg), 在室温下以25 Hz的频率研磨2 h。

物理混合物: 将IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶中涉及的起始组分放入锥形离心管中, 然后将锥形离心管放在旋涡混合器上旋转2 min, 得到的三种物理混合物中涉及的起始组分的质量和化学计量比与其共晶一致。

将起始组分、 相应的物理混合物和共晶研磨成粉末放入压片机中, 在6 MPa的压力下约1 min。 制备的样品为直径13 mm、 厚度1～2 mm的圆片, 放入密封袋中进行后续的太赫兹检测。

1.2 样品表征

太赫兹时域光谱(Terahertz time-domain spectroscopy, THz-TDS)采用Z2(美国Zomega公司)透射式测量系统。 使用锁模钛宝石激光器系统(美国Spectral Physics公司)的光脉冲序列驱动光电导开关产生和检测太赫兹辐射, 频率为75 MHz, 脉冲宽度为100 fs, 中心波长为780 nm。 测量环境为室温、 干燥的氮气环境以及相对湿度低于1%。

1.3 理论计算

作为量子化学模拟的有力工具, 高斯软件可以模拟各种几何结构和光谱性质。 本文采用Gaussian 09软件结合Gaussian-View使用密度泛函理论B3LYP泛函和6-311++G(d, p)基组对IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的理论结构进行了模拟和优化[16-17]。 根据IA、 GA和PZA的结构信息、 氢键的合成规律以及参考Kulla[12]等对IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的结构研究, 对每个共晶都模拟了理论上可能的分子结构。 根据IA与GA的分子结构, 选取了两种最有可能的氢键合成元形式。 IA-GA共晶理论形式Ⅰ的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元[图2(a)所示], 理论形式Ⅱ中的氢键构成为GA一侧羧基中的羰基与IA酰胺基团中氨基形成羧基-酰胺异合成元[如图2(b)所示]。 根据PZA与GA的分子结构, 选取了两种最有可能的氢键合成元形式。 PZA-GA共晶理论形式I的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与PZA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元[如图3(a)所示], 理论形式Ⅱ中的氢键构成为GA一侧羧基中的羰基与PZA酰胺基团中氨基形成羧基-酰胺异合成元[如图3(b)所示]。 根据IA、 GA和PZA的分子结构, 选取了两种最有可能的氢键合成元形式。 IA-PZA-GA共晶理论形式I的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元, 另一侧的羧基中的羟基则与PZA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元[如图4(a)所示]。 理论形式Ⅱ中的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元, 而IA中的酰胺与PZA中的酰胺形成酰胺-酰胺同合成元[如图4(b)所示]。

图2 IA-GA共晶的两种理论分子结构形式Ⅰ(a)和形式Ⅱ(b)Fig.2 Two theoretical molecular structures of IA-GA cocrystal form Ⅰ (a) and form Ⅱ (b)

图3 PZA-GA共晶的两种理论分子结构形式Ⅰ(a)和形式Ⅱ(b)Fig.3 Two theoretical molecular structures of PZA-GA cocrystal form Ⅰ (a) and form Ⅱ (b)

图4 IA-GA-PZA共晶的两种理论分子结构形式Ⅰ(a)和形式Ⅱ(b)Fig.4 Two theoretical molecular structures of IA-GA-PZA cocrystal form Ⅰ (a) and form Ⅱ (b)

2 结果与讨论

2.1 太赫兹时域光谱分析

IA、 GA、 物理混合物及IA-GA共晶在0.2～1.8 THz频率范围的THz吸收光谱如图5所示。 从图中可以看出, IA在该区域仅有一个吸收峰, 位于1.46 THz处。 GA在该区域并没有观察到吸收峰。 IA和GA的物理混合物在1.46 THz处有一个吸收峰, 这表明物理混合物的吸收峰仅基于两种起始组分IA和GA的线性叠加。 然而, IA和GA均与IA-GA共晶显示出完全不同的吸收峰。 IA-GA共晶具有独特的吸收峰, 分别位于0.98、 1.18和1.64 THz处, 这证实了新物质IA-GA共晶的形成。 类似地, GA、 PZA、 物理混合物和PZA-GA共晶的THz吸收光谱如图6所示。 从图中可以看出, GA的THz吸收峰与图5展示的一致, PZA的THz吸收峰分别位于0.52、 0.72和1.44 THz处。 PZA-GA共晶在0.60、 1.33和1.66 THz处有三个吸收峰, 这些峰在两个起始组分PZA和GA以及它们的物理混合物中都没有观察到, 这证实了新物质PZA-GA共晶的形成。 IA、 GA、 PZA、 物理混合物和共晶的THz吸收光谱如图7所示。 从图中也可以看出, PZA的THz吸收峰与图6展示的一致, 物理混合物有三个吸收峰, 这三个吸收峰只是单纯的来自于IA, GA和PZA吸收峰的叠加。 然而, IA-GA-PZA共晶在0.91、 1.13和1.47 THz处出现了在物理混合物中没有被观察到的吸收峰, 这也证实了新物质IA-GA-PZA共晶的形成。 从上述图中可以得出结论, 起始组分通过机械研磨的方法成功地合成了两种二元共晶和一种三元共晶。 这是因为在研磨过程中起始组分之间存在非共价键相互作用, 特别是分子间强烈氢键的驱动力, 使得起始组分的分子结构发生细微变化, 从而诱导共晶的形成, 最终形成了相应的共晶结构。 也正是因为THz光谱对固态晶体分子结构微弱变化非常敏感, 能准确的提供分子结构的指纹信息, 所以二元和三元共晶所展示的THz光谱与起始组分显示出不同的吸收峰。

图6 GA(a)、 PZA(b)、 物理混合物(c)和PZA-GA共晶(d)的THz吸收光谱Fig.6 THz absorption spectra of GA (a), PZA (b), physical mixture (c) and PZA-GA cocrystal (d)

结合上述IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的形成, 可以推测在有足量起始组分的条件下, 这三种共晶都可以形成。 同时我们可以看出GA分子都参与了这三种共晶的形成, 如果IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶之间不存在互相转化, 则最终的结果是该三种共晶都成功制备。 但是化学计量比为1∶1∶1的起始组分经充分研磨后形成的只有IA-GA-PZA三元共晶, 并且IA-GA-PZA三元共晶的THz吸收光谱中并没有出现IA-GA、 PZA-GA二元共晶的THz吸收峰, 说明充分研磨后的样品最终生成的只有IA-GA-PZA三元共晶。 对此现象做出的解释是IA-GA-PZA三元共晶是比IA-GA和PZA-GA二元共晶更加稳定的, 在研磨的过程中即使生成了IA-GA、 PZA-GA二元共晶, 在外力的作用下它们会继续向更加稳定的IA-GA-PZA三元共晶转化。

2.2 晶体结构分析

分子在太赫兹低频波段的振动主要源于两个或多个原子参与的变形振动, 伸缩振动, 弯曲振动和包括氢键在内的分子相对运动[13]。 IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶中氢键的形成使得共晶有了不同的内部分子结构, 从而体现出不同的特征吸收谱。 所以, 为了表征IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶结构中具体的氢键位置, 从而确定二元共晶氢键合成元对预测三元共晶氢键合成元的理论结构是否有重要的参考价值, 我们根据IA、 GA和PZA的结构信息以及氢键的合成规律, 通过高斯软件对每个共晶都模拟了理论上可能的两种分子结构(如图2, 图3和图4所示)。

图8显示了实验IA-GA共晶和理论计算的THz吸收光谱。 与IA-GA共晶理论形式Ⅱ光谱结果相比, IA-GA共晶理论形式Ⅰ在1.08、 1.23和1.63 THz处具有的三个吸收峰与IA-GA共晶实验结果比较接近, 因此, IA-GA共晶理论形式Ⅰ更符合IA-GA共晶的实际形成模式, IA-GA共晶理论形式Ⅰ的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元。 图9显示了实验PZA-GA共晶和理论计算的THz吸收光谱。 PZA-GA共晶理论形式Ⅰ具有的三个吸收峰与PZA-GA共晶实验结果比较接近, 因此, PZA-GA共晶理论形式Ⅰ更符合PZA-GA共晶的实际形成模式, PZA-GA共晶理论形式Ⅰ的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与PZA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元。 图10显示了实验IA-GA-PZA共晶和理论计算的THz吸收光谱。 IA-GA-PZA共晶理论形式Ⅱ具有的三个吸收峰与IA-GA-PZA共晶实验结果比较接近, 因此, IA-GA-PZA共晶理论形式Ⅱ更符合IA-GA-PZA共晶的实际形成模式, IA-GA-PZA共晶理论形式Ⅱ的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元, 而IA中的酰胺与PZA中的酰胺形成酰胺-酰胺同合成元。 实际上, 我们可以看到共晶理论形式与实验结果的吸收峰之间还是存在一些频移, 这些吸收峰偏移的原因是理论模拟是在绝对零度下进行的, 而实验的THz光谱是在室温下获得的[18]。 与此同时, 理论模拟只是计算了整个共晶分子网络的一个结构单元, 而实验共晶光谱是整个固态共晶分子网络的表征, 也可能会引起一些频移[19]。 最后, 把DFT计算得到的IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的理论THz光谱与实验进行对比, 发现IA-GA-PZA三元共晶的氢键形式并不单纯的是两个IA-GA、 PZA-GA二元共晶氢键形式的叠加, 只是存在部分相同氢键合成元。 所以, IA-GA、 PZA-GA二元共晶氢键形式的叠加与IA-GA-PZA三元共晶的氢键形式并不是完全一致的, 但是这两种二元共晶的氢键形式对预测三元共晶的氢键形式具有极为重要的参考价值。

图8 比较实验IA-GA共晶(a)、 理论共晶形式Ⅰ(b)和形式Ⅱ(c)的THz吸收光谱Fig.8 Comparisons of THz absorption spectra of experimental IA-GA cocrystal (a), theoretical cocrystal form Ⅰ (b) and form Ⅱ (c)

图9 比较实验PZA-GA共晶(a)、 理论共晶形式Ⅰ(b)和形式Ⅱ(c)的THz吸收光谱Fig.9 Comparisons of THz absorption spectra of experimental PZA-GA cocrystal (a), theoretical cocrystal form Ⅰ (b) and form Ⅱ (c)

图10 比较实验IA-GA-PZA共晶(a)、 理论共晶形式Ⅰ(b)和形式Ⅱ(c)的THz吸收光谱Fig.10 Comparisons of THz absorption spectra of experimental IA-GA-PZA cocrystal (a), theoretical cocrystal form Ⅰ (b) and form Ⅱ (c)

表1 IA-GA-PZA共晶的THz振动模式Table 1 THz vibration modes of IA-GA-PZA cocrystal

3 结 论

采用机械研磨方法成功地合成了两种IA-GA、 PZA-GA二元共晶和一种IA-GA-PZA三元共晶。 通过THz-TDS技术对起始组分、 相应的物理混合物和共晶进行了表征。 THz吸收光谱实验结果表明, IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶都显示出各自独特的光谱特征。 此外, 采用DFT对IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶理论上可能的两种分子结构进行了优化计算。 晶体结构分析表明, IA-GA共晶的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元。 PZA-GA共晶的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与PZA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元。 IA-GA-PZA共晶的氢键构成为GA一侧羧基中的羟基与IA中的吡啶N形成羧基-吡啶N异合成元, 而IA中的酰胺与PZA中的酰胺形成酰胺-酰胺同合成元。 最后, 把DFT计算得到的IA-GA、 PZA-GA二元共晶和IA-GA-PZA三元共晶的理论THz光谱与实验进行对比, 发现IA-GA、 PZA-GA二元共晶氢键形式的叠加与IA-GA-PZA三元共晶的氢键形式并不是完全一致的, 但是这两种二元共晶的氢键形式对预测三元共晶的氢键形式具有极为重要的参考价值。 与此同时, 我们还根据理论模拟结果, 对IA-GA-PZA三元共晶的振动模式进行了归属, 发现它与相应的氢键密切相关, 这进一步证明了氢键的成键模式以及氢键在共晶形成中的重要作用。 利用THz光谱结果和振动模式分配, 也证实了THz光谱不仅能够应用于二元共晶的检测, 同时在结构更为复杂的三元共晶的检测上也有很高的灵敏度和准确度。 这些结果对THz光谱建立和评估更为复杂的共晶结构模型具有重要意义。