16 种杀菌剂对3 种水稻病原细菌的室内抑菌效果研究

侯雨萱 于林 李阳 谌江华

（1 中国水稻研究所/水稻生物育种全国重点实验室，杭州 311400；2 丽水市土肥植保能源总站，浙江 丽水323000；3 宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040；*第一/通信作者：houyuxuan@caas.cn）

植物病原细菌是一类重要的病原微生物，包含假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、欧文氏菌属（Erwinia）、雷尔氏菌属（Ralstonia）、泛菌属（Pantoea）和肠杆菌属（Enterobacter）等20 多个属，造成我国粮食和经济作物上约70 种细菌性病害的发生流行[1]。

黄单胞菌属代表种稻黄单胞杆菌致病变种（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）引起的白叶枯病是危害水稻的世界性重要病害，引起水稻叶片产生黄褐色或白色病斑，影响植物光合作用，一般造成水稻减产10%~30%，重则减产50%以上，甚至绝收[2]。20 世纪70—90年代，我国除了新疆、西藏等地未见报道，白叶枯病在全国其余各水稻产区均有发生和流行，成为危害我国水稻生产的三大流行性病害之一[3]。

菠萝泛菌属于泛菌属（Pantoea ananatis），早期研究认为，菠萝泛菌是一种植物内生菌或者腐生细菌，但近些年的研究表明，菠萝泛菌是一种非常重要的植物病原细菌，可以侵染菠萝、洋葱、哈密瓜、杏鲍菇、桉树、小麦、玉米和水稻等多种单子叶和双子叶植物，造成叶片和茎秆产生病斑、枯萎、果实腐烂等多种病症，引发新型病害的流行[4-14]。特别在水稻上，是一种新上升的可引起水稻严重病症的病原菌，在中国、日本、韩国、印度、泰国、马来西亚、俄罗斯、意大利、土耳其、澳大利亚、贝宁、多哥都有菠萝泛菌侵染水稻造成危害的报道，其主要使水稻叶片产生病斑、枯萎、茎坏死、鞘腐烂、内稃褐变和谷粒变色等症状[15-16]。

阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）属于肠杆菌属，广泛分布于水、土壤和食物上，可以与茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）一起引发生姜青枯病；还可侵染桑树，使其叶片失水凋萎枯焦，直至脱落，剥开主干层可见木质部褐色条状斑[17-18]。最近XUE 等[19]报道，阿氏肠杆菌和菠萝泛菌也会侵染水稻，造成水稻叶片产生白叶枯病类似症状。

3 种病原细菌都可引起水稻叶部病害，稻黄单胞杆菌致病变种引起的白叶枯病老病新发。据统计，位于长江中下游的宁波市自2018 年起白叶枯病发生面积逐年增加，2021 年达到4 334.7 hm2次，感病品种包括甬籼15、中早39、甬优1540、甬优15、甬优538、宁84和宁88 等当地主栽品种[20]，原有抗病品种对新流行菌株抗性丧失，化学药剂防治仍是当前防治的首要措施。由菠萝泛菌和阿氏肠杆菌引起的新发病害，没有抗性品种资源基础，筛选适宜的化学防治药剂成当务之急。目前登记的防治白叶枯病的常规药剂主要有铜制剂、有机磷、有机氮、苯基酰胺磷，及噻唑类等杂环化合物和农用抗生素等，但这些药剂对白叶枯病的新流行株以及新发的病原菌是否有效还未可知。为了有效防治水稻叶部的细菌性病害，作者收集了16 种市售的防治细菌性病害杀菌剂进行室内抑菌活性测定和评价，以期筛选出同时针对上述3 种病原细菌的高效杀菌剂，为水稻新发的细菌性病害精准防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂

40%链霉素可湿性粉剂，华北制药集团爱诺有限公司；80%乙蒜素乳油，河南比赛尔农业科技有限公司；3%中生菌素可湿性粉剂，深圳诺普信农化股份有限公司；35%喹啉铜四霉素悬浮剂，青岛奥迪斯生物科技有限公司；6%春雷霉素可湿性粉剂，江门市植保有限公司；40%春雷噻唑锌悬浮剂，浙江新农化工股份有限公司；20%噻唑锌悬浮剂，浙江新农化工股份有限公司；20%噻菌铜悬浮剂，浙江龙湾化工有限公司；20%噻森铜悬浮剂，浙江东风化工有限公司；23%松脂酸铜乳油，山东禾宜生物科技有限公司；70%丙森锌可湿性粉剂，拜耳集团；50%氯溴异氰尿酸可溶性粉剂，江苏东宝农化股份有限公司；20%叶枯唑可湿性粉剂，陕西上格之路生物科技有限公司；8%宁南霉素水剂，德强生物股份有限公司；50%咯菌腈可湿性粉剂，瑞士先正达作物保护有限公司；16%多抗霉素可溶性粒剂，乳山韩威生物科技有限公司。

1.1.2 供试菌株

2021 年分别于浙江富阳、绍兴和杭州种植的水稻品种甬优1540 上具有褐色病斑、萎蔫、卷缩等症状的病叶中分离鉴定的稻黄单胞杆菌致病变种FY517、菠萝泛菌SX1 和阿氏肠杆菌HZ27。经柯赫氏法则验证，FY517 室内剪叶接种、SX1 和HZ27 室内刮擦后喷雾接种甬优1540，14 d 后均能产生不同程度的褐色病斑。

1.2 试验方法

1.2.1 制备含有病原菌的PSA 平板

取-80 ℃贮存的FY517、SX1 和HZ27 菌液，分别在NA 平板上（聚蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0）划线，28 ℃培养48~72 h；挑取单克隆至100 mL M210 液体培养基（酵母提取物4 g，酵水解干酪素8 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0）于28 ℃、200 rpm 条件下培养至OD600值约到1.0。准备60 mL PSA 液体培养基（蛋白胨10 g，L-谷氨酸1 g，蔗糖10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0），加入1%琼脂糖高温高压灭菌，冷至50 ℃，加入6 mL 上述制备的病原菌菌液（OD600=1.0），快速均匀混合后倒于平板，每板约15 mL。

1.2.2 制备不同浓度的药剂

将各杀菌剂配制成有效浓度为10 000 mg/L，作为原液，分别在无菌1.5 mL 离心管中用水稀释成10X、100X 和1 000X 液。

1.2.3 测试抑菌活性

分别取5 μL 杀菌剂的系列稀释液，在超净工作台中慢慢点到高温高压灭菌过滤纸圆片上，吹干，转移至含有病原菌的PSA 平板上，28 ℃培养48 h，观察病原菌在PSA 平板中的生长和测量抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 16 种杀菌剂对3 种病原细菌的抑菌活性测定

本研究采用抑菌圈法测定16 种杀菌剂对水稻上的3 种病原细菌稻黄单胞杆菌致病变种FY517、菠萝泛菌SX1 和阿氏肠杆菌HZ27 的敏感性。结果（表1）表明，除了8%宁南霉素、50%咯菌腈和16%多抗霉素，其余13 种农药对FY517 都有不同程度的抑菌作用，抑菌圈直径在6.1~22.2 mm 之间，抑菌效果最好的是80%乙蒜素，其次是3%中生菌素，最差的是50%氯溴异氰尿酸和20%叶枯唑；常用的白叶枯防治药剂40%春雷噻唑锌、20%噻唑锌、20%噻菌铜和20%噻森铜等在离体条件下的抑菌效果不佳，抑菌圈小于10.0 mm。40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素、6%春雷霉素、50%氯溴异氰尿酸和70%丙森锌这7 种杀菌剂对SX1 有不同程度的抑菌效果，抑菌圈直径在6.8~27.8 mm 之间，抑菌效果最好的是40%链霉素，其次是80%乙蒜素，最差的是70%丙森锌。40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素这5 种杀菌剂对HZ27 有抑菌作用，且效果依次降低，最高为40%链霉素，抑菌圈直径为24.2 mm，最差为35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素，抑菌圈直径只有6.2 mm。

表1 16 种杀菌剂对水稻上3 种病原细菌的室内抑菌效果

所有杀菌剂随着药剂的稀释抑菌效果降低，40%链霉素有效作用浓度最低，在原液稀释100 倍后仍对SX1 和HZ27 有抑菌效果；其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素，原液稀释10倍后对3 菌均有抑制作用；清水对照抑菌圈直径为0，没有抑菌作用（表1）。

2.2 对3 病原细菌均起抑制作用的5 种杀菌剂抑菌效果比较

从16 种杀菌剂对3 菌的抑菌试验数据来看，只有40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素等5 种杀菌剂对3 细菌菌株都有抑菌作用，且抑制作用随着药剂的稀释逐渐降低（图1）。当杀菌剂浓度为原液（10 000 mg/L）时，40%链霉素对SX1 的抑制作用最强，HZ27 次之，FY517 相对较差；80%乙蒜素对SX1 的抑制作用最强，FY517 次之，HZ27相对较差；3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素对FY517 的抑制作用最强，SX1 次之，HZ27 相对较差（图2A）；当杀菌剂在原液的基础上稀释10 倍时，40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素4 种杀菌剂对3 种菌株同时均有抑制作用，且作用趋势与相应原液基本一致（图2B）。

图1 5 种抗生素类药剂对3 种病原细菌形成的抑菌圈

图2 5 种抗生素类药剂对3 种病原细菌的抑菌活性比较

从数据分析结果来看，在离体平板上单独抑制稻黄单胞杆菌致病变种FY517，首推80%乙蒜素，其次是40%链霉素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素，20%噻唑锌和20%噻菌铜等金属类制剂有一定抑制作用，但效果没有前二者强；单独抑制SX1 和HZ27，首推40%链霉素，其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素。

对于这3 种新出现的水稻细菌性病害的流行株，室内的16 种杀菌抑菌活性试验表明，抗生素类药剂的离体平板抑菌效果较好，且对3 种菌株同时有抑菌作用，鉴于40%链霉素已在大田防治中禁用，作者建议在大田同时防治3 种新发病害时可以使用80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素。

3 讨论

近年由于气候环境和耕作制度的变化以及病原菌生理小种的不断变异，水稻白叶枯病在浙江等省份又开始大面积流行，菠萝泛菌和阿氏肠杆菌引起的新病害也突现，这3 种病原细菌都能致水稻叶部产生病斑、萎缩、枯萎，影响光合作用，降低水稻产量。本研究针对这一突现紧急生产问题，进行了市售16 种杀菌剂对3种病原细菌菌株的离体抑菌试验，发现40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素这5 种抗生素类杀菌剂同时对3 种病原细菌菌株具有显著抑菌作用，80%乙蒜素对稻黄单胞杆菌致病变种FY517 的抑菌效果最佳，40%链霉素对SX1 和HZ27 抑菌效果最佳。

40%春雷噻唑锌、20%噻唑锌和20%噻菌铜等金属类制剂对稻黄单胞杆菌致病变种引起的白叶枯病田间防效好，防治效果可以达到69.6%~90.7%[21-22]。但在我们的室内试验中，以上3 种杀菌剂对稻黄单胞杆菌致病变种新流行株FY517 有一定程度的抑制作用，能形成抑菌圈，但抑菌圈直径显著小于40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素等5 种抗生素类杀菌剂形成的抑菌圈。余山红等[23]也证实，噻唑锌、噻森铜和噻菌铜对近期从浙江临海分离的白叶枯病新流行菌株室内抑菌效果不佳，丙硫唑和中生菌素等的室内抑菌效果好。这两项研究中使用的供试菌株均为新分离的流行菌株，噻唑锌等对其室内抑菌效果不佳，可能是由于噻唑锌等的大量使用，新流行菌株产生部分抗性；亦或是新流行菌株的变异导致原有金属类制剂的抑菌活性正在逐步降低。

在我们的试验中筛选到3%中生菌素、80%乙蒜素等5 种抗生素对菠萝泛菌有显著的抑菌作用。王大会等[24]报道，1.6%噻霉酮、3%中生菌素和80%乙蒜素对烟草叶枯病的致病菌成团泛菌（Pantoea agglomerans）有较好的抑菌效果，抑制中浓度值分别4.0、13.5 和117.6 μg/mL，综合来看，3%中生菌素和80%乙蒜素对泛菌有显著抑菌效果，可以作为防治药剂。另外也有报道，Bacillus licheniformis产生的抗菌肽A 通过阻碍菠萝泛菌的细胞壁和细胞膜合成来抑制其生长[25]。这表明我们可以进一步筛选生防菌来精准绿色防治菠萝泛菌引起的病害。

蒙姣荣等[26]测定了包括中生菌素在内的10 种药剂对引起桑树细菌性枯萎病的阿氏肠杆菌的药效，发现中生菌素抑菌效果最好，最低有效抑制浓度为11.3~15.0 μg/mL；农用链霉素次之，最低有效抑制浓度为7.5~113.0 μg/mL。而在我们的试验结果中对阿氏肠杆菌抑菌效果最好的是40%链霉素，其次是80%乙蒜素和3%中生菌素，导致这个抑菌效果的差异可能是由于供试菌株来源于不同寄主的不同株系。

后续作者将以同时对3 种病原细菌具有显著抑菌作用的40%链霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉铜四霉素和6%春雷霉素为供试药剂，进行温室盆栽和田间小区试验，以明确这几种药剂的田间实际防治效果，为精准防治水稻细菌性叶部病害提供参考和指导。