川芎多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

赵威瑾,李 畅,李知娟,王 经,芦晓囡

(邯郸市中心医院,河北 邯郸 056008)

心肌缺血后再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)指急性心肌梗死后,冠状动脉部分或完全阻塞,经过治疗又重新再通,血管损伤反而呈短暂加重的病理生理现象。MIRI病理机制复杂,有研究报道氧化应激和炎症反应在MIRI进展过程中发挥着重要作用[1-2]。

中医没有MIRI病名,根据其症状可归属“胸痹”“真心痛”等范畴,其病机在于“阳气亏虚、痰瘀内阻”,宜采取“温阳化气、活血化瘀、祛痰化浊”等方案治疗[3]。中药川芎性温味辛,归肝、胆、心包经,具有活血行气、祛风止痛等功效,常用于胸痹心痛、胸胁刺痛、经闭痛经、癥瘕腹痛等的治疗。川芎多糖是中药川芎的活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理学作用[4-5]。赵玉等[6]研究显示,川芎多糖通过抑制氧化应激和炎症反应能够有效减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,但川芎多糖对MIRI的影响尚未见文献报道。本研究构建MIRI大鼠模型并于造模前予川芎多糖预处理14 d,探讨川芎多糖对大鼠MIRI的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:144只7周龄清洁级雄性SD大鼠由天津科德生物科技公司提供,动物许可证号:SCXK(津滨)2021-0001。大鼠于清洁环境分笼饲养,控制室温23～25 ℃、相对湿度50%～70%、光照/黑暗12 h∶12 h。本研究经过邯郸市中心医院伦理委员会审批通过[伦理号:HDZXLL(K)字2022-009]。所有实验动物相关操作严格遵循3R原则。

1.1.2 实验药物与试剂:川芎多糖(批号WKQ-0008433,四川维克奇);维拉帕米片(批号2111026,江苏四环生物制药);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(批号SEKR-0048、SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005,北京索莱宝);丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)分光光度法检测试剂盒(批号BC0020、BC0170、BC4780,北京索莱宝);HE、TUNEL染色试剂盒(批号D006-1-1、G001-2-1,南京建成生物);高迁移率族蛋白B1(HMGB1)抗体、β-actin抗体、IgG二抗、ECL显色液(批号bs-0664R、bs-0061R、bs-0294P、C05-07004,北京博奥森)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备与给药:将144只大鼠随机分为假手术组、模型组、维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组,每组24只。造模前14 d开始,维拉帕米组大鼠灌胃维拉帕米20 mg/(kg·d),川芎多糖低、中、高剂量组大鼠分别灌胃川芎多糖50、100、200 mg/(kg·d)[7]。末次给药12 h后,除假手术组外,其余组大鼠参照文献[8]通过夹闭冠状动脉左前降支30 min构建MIRI大鼠模型。夹闭左前降支后心尖部位呈苍白色、心电图ST段抬高≥0.2 mV,提示存在心肌缺血;30 min后松开动脉夹恢复血流灌注,心尖部位变红润、ST段高度明显回落,即可判定MIRI大鼠模型制备成功[9]。

1.2.2 超声心动图检测大鼠心功能:再灌注2 h后,每组分别随机取8只大鼠,麻醉后通过超声影像系统检测大鼠心功能,检测指标包括左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVEDs)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短分数(LVFS),每只大鼠测量3个心动周期取平均值。

1.2.3 心肌梗死面积:颈椎脱臼处死大鼠后开胸取心脏,0.9%氯化钠溶液冲洗干净,由心尖至心底横向均匀切成5片,置于1% NBT染色液中37 ℃避光孵育30 min,运用Image J图像分析软件计算心肌梗死面积百分比,紫黑色为正常组织,苍白色为梗死区。

1.2.4 心肌组织病变观察及病理评分:另取每组8只大鼠处死取心脏,10%中性甲醛溶液中固定72 h,然后依次行脱水、浸蜡、4 μm厚度切片、烤片、脱蜡、透明等处理后,行HE染色,封片,光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织病理学改变。分别从出血、间质水肿、炎性浸润、坏死4个方面进行评分[10],无病变计0分,病变面积占视野面积比例≤1/4计1分,1/4<病变面积占视野面积比例≤1/2计2分,1/2<病变面积占视野面积比例≤3/4计3分,4个方面评分之和即为病理评分。

1.2.5 心肌细胞凋亡情况及凋亡指数计算:取心肌组织石蜡切片,经脱蜡、透明等处理后,按照试剂盒操作说明行TUNEL染色,光学显微镜下观察心肌细胞凋亡状况,细胞核黄褐色为阳性着色。每张切片随机选取5个视野计数细胞总数和凋亡细胞数,凋亡细胞数所占百分比即为凋亡指数。

1.2.6 心肌组织生化指标检测:取每组剩余的8只大鼠,处死后取心脏,取部分左心室心肌组织研磨匀浆,3500 r/min离心10 min取上清,遵照试剂盒说明采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量,分光光度法检测MDA含量及SOD、CAT活性。

1.2.7 心肌组织HMGB1蛋白表达检测:取左心室心肌组织100 mg,加1 ml RIPA裂解液冰上匀浆和裂解后提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭1.5 h后,加一抗HMGB1、β-actin抗体4 ℃孵育过夜,二抗37 ℃孵育1 h,ECL显影,通过蛋白条带灰度值以β-actin为内参计算HMGB1相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间多重比较采用LSD-t检验;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 见表1。模型组大鼠LVEDd、LVEDs明显高于假手术组,LVEF、LVFS明显低于假手术组(P<0.05)。维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠LVEDd、LVEDs明显低于模型组,LVEF、LVFS明显高于模型组(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组间效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组大鼠LVEDd明显降低,LVEF、LVFS明显升高(P<0.05),两组间LVEDs比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠心功能指标比较

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较 见表2(图1)。模型组大鼠心肌梗死面积明显高于假手术组(P<0.05)。维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠心肌梗死面积明显低于模型组(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组间效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组大鼠心肌梗死面积明显降低(P<0.05)。

2.3 各组大鼠心肌组织病理学改变 见表3(图2)。假手术组大鼠心肌纤维形态正常,细胞结构完整。模型组大鼠呈现心肌纤维断裂、排列紊乱,细胞空泡样变、坏死,核膜核仁边界不清,间质区水肿、炎性细胞浸润等病理学改变。与模型组比较,维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠心肌组织上述病变不同程度改善,川芎多糖低、中、高剂量组改善效果呈剂量依赖性,且川芎多糖高剂量组效果优于维拉帕米组。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织病理评分明显升高(P<0.05);与模型组比较,维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠病理评分明显降低(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组呈现剂量依赖性(P<0.05);与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组病理评分明显降低(P<0.05)。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较 见表4(图3)。假手术组大鼠心肌组织仅可见极少量散在的凋亡细胞。模型组大鼠心肌凋亡细胞数量较假手术组增多,凋亡指数较假手术组明显升高(P<0.05)。与模型组比较,维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠心肌凋亡细胞数量不同程度减少,凋亡指数明显降低(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组大鼠心肌凋亡细胞数量明显减少,凋亡指数明显降低(P<0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:维拉帕米组;D:川芎多糖低剂量组;E:川芎多糖中剂量组;F:川芎多糖高剂量组

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较(%)

2.5 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 见表5。模型组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显高于假手术组(P<0.05)。维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显低于模型组(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组间效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。

表5 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较(pg/ml)

2.6 各组大鼠心肌组织MDA含量和SOD、CAT活性比较 见表6。模型组MDA含量明显高于假手术组,SOD、CAT活性明显低于假手术组(P<0.05)。维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组MDA含量明显低于模型组,SOD、CAT活性明显高于模型组(P<0.05),川芎多糖低、中、高剂量组间效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组MDA含量明显降低,SOD活性明显升高(P<0.05),两组间CAT活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表6 各组大鼠心肌组织MDA含量和SOD、CAT活性比较

2.7 各组大鼠心肌组织HMGB1蛋白表达比较 见表7(图4)。模型组大鼠心肌组织HMGB1蛋白表达明显高于假手术组(P<0.05)。维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组大鼠心肌组织HMGB1表达明显低于模型组(P<0.05),且川芎多糖低、中、高剂量组间效应呈剂量依赖性(P<0.05)。与维拉帕米组比较,川芎多糖高剂量组大鼠心肌组织HMGB1表达明显降低(P<0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:维拉帕米组;D:川芎多糖低剂量组;E:川芎多糖中剂量组;F:川芎多糖高剂量组

表7 各组大鼠心肌组织HMGB1蛋白表达比较

3 讨 论

心肌缺血后再灌注损伤指冠状动脉部分或完全急性阻塞后,重建血流后心肌反而出现进行性加重的损伤状态[11-13]。川芎多糖是天然存在于中药川芎的一类吡喃型多糖化合物,包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖等。本研究结果显示,川芎多糖预处理可呈剂量依赖性降低LVEDd和LVEDs,提高LVEF和LVFS,改善MIRI大鼠心功能指标。HE染色和TUNEL染色结果显示,川芎多糖可剂量依赖性抑制MIRI大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱,细胞空泡样变、坏死,间质区水肿、炎性细胞浸润等病变以及细胞凋亡,降低病理评分和凋亡指数。提示川芎多糖具有改善MIRI大鼠心功能、减轻心肌组织病变和细胞凋亡的作用。

氧化应激和炎症反应是MIRI的重要病理机制之一,是导致缺血半暗带细胞坏死或凋亡、增大梗死面积的重要因素[14-15]。研究发现,心肌缺血再灌注过程大量产生活性氧簇(ROS),大量消耗SOD、CAT等内源性抗氧化酶,破坏“ROS生成-还原清除”动态平衡而引发氧化应激损伤[16-17]。ROS可破坏血管内皮细胞,刺激TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子释放而引发炎症反应,TNF-α和IL-1β可刺激中性粒细胞等向损伤部位聚集并进一步分泌促炎因子,形成炎症级联反应,IL-1β能够促进炎性细胞浸润,从而加重炎症损伤[18]。本研究结果显示,川芎多糖可剂量依赖性抑制MIRI大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量升高和SOD、CAT活性降低。

HMGB1是一种核蛋白,在MIRI进展过程中发挥着重要调控作用。ROS可刺激HMGB1转录表达,并促进向ox-HMGB1型转化,ox-HMGB1可通过激活NLRP3炎性小体而促进TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子释放[19-20]。本研究结果显示,川芎多糖可剂量依赖性抑制MIRI大鼠心肌组织HMGB1表达上调,川芎多糖高剂量组作用优于维拉帕米组。提示川芎多糖具有抑制MIRI大鼠心肌组织HMGB1表达的作用。

综上所述,川芎多糖可改善MIRI大鼠心功能、减轻心肌组织病变和细胞凋亡。