紫朱软膏对糖尿病溃疡小鼠创面炎症反应及上皮-间充质转化的影响

黄仁燕,王宏飞,王徐红,柳国斌

(上海中医药大学附属曙光医院血管外科,上海 201203)

糖尿病足溃疡是糖尿病患者截肢的主要原因,同时也是糖尿病患者死亡的重要原因之一[1-2]。糖尿病足溃疡发病率约19%～34%,截肢率达52%以上,5年内再次截肢率约45.72%[3]。此外,糖尿病足溃疡患者5年内病死率高达30.5%[4]。糖尿病足溃疡治愈率低、复发率较高、预后不良,严重影响糖尿病患者的生活质量[5-6]。再上皮化障碍是糖尿病足溃疡难愈合的主要原因之一[7-8]。糖尿病足溃疡在愈合早期常出现过度的炎症反应,愈合中晚期常出现再上皮化障碍,从而延缓整个愈合进程[9]。再上皮化是上皮细胞在肉芽组织上通过迁移和增殖覆盖创面使其完全愈合的过程,而糖尿病足溃疡因长期处于高糖环境,成纤维细胞、上皮细胞等细胞的迁移减少,导致再上皮化障碍,使创面经久难愈[10-11]。糖尿病足溃疡属于中医“脱疽”“筋疽”范畴,邪气致瘀为本病基本病因病机,因此治疗应“扶正祛邪”并用。紫朱软膏是上海中医药大学附属曙光医院研制的治疗糖尿病足溃疡的外用药膏,由朱砂、紫草、阿胶、冰片、龙血竭、黄芪等组成,具有清热解毒、祛腐生肌之效。研究显示,紫朱软膏能有效提高糖尿病足溃疡临床疗效[12],但其具体作用机制尚未明确。因此,本研究通过观察紫朱软膏对糖尿病溃疡小鼠炎症反应、上皮-间充质转化的影响,为中医药治疗糖尿病足溃疡提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:C57B/L小鼠由上海中医药大学实验中心提供,伦理编号:PZSHUTCM190308012,体重(27±8.0)g,12 h∶12 h的光-暗循环饲养,湿度(60±3)%,温度(25±2)℃,自由饮水和进食。

1.1.2 实验药物与试剂:紫朱软膏(批号130301,规格30 g)由朱砂、紫草、阿胶、冰片、龙血竭、黄芪等组成。白介素(Interleukin,IL)-6抗体(批号CSBE04639,美国Proteintech公司);肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗体(批号CSBE04741,美国Proteintech公司);IL-4抗体(批号M201804,苏州卡尔文生物);IL-10抗体(批号M201807,苏州卡尔文生物);一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,iNOS)抗体(批号AF0199,美国Affinity公司);Snail抗体(批号AF6032,江苏亲科生物);α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(批号23081-AP,武汉三鹰生物);β-连环蛋白(β-catenin)抗体(批号8480T,美国Cell Signal公司);上皮细胞钙黏蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)抗体(批号ab185335,美国Abcam公司);Western一抗稀释液(批号P0023A,上海碧云天);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(批号ANT30002,上海碧云天)。

1.1.3 主要实验仪器:烫伤仪(型号SQL-5Q,上海欣软信息科技有限公司);电泳仪(型号EPS300,上海天能);低温高速离心机(型号MIKRO220R,Hettich公司);荧光定量PCR仪(型号LightCycler 96,罗氏公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型的建立:糖尿病溃疡模型的制备:将C57B/L小鼠高脂饲料连续饲养3周后,腹腔注射40 mg/(kg·d)链脲佐菌素,连续7 d。当空腹血糖≥250 mg/dl时,糖尿病模型制备成功。模型制备成功后改为普通饲养喂养3周,采用烫伤仪烫伤小鼠背部,烫伤第2天烫伤组织病理示深Ⅱ度烫伤即模型制备成功。普通溃疡模型制备:小鼠予普通饲料连续饲养3周后,采用SQL-5Q烫伤仪烫伤小鼠背部,烫伤第2天取烫伤组织病理示深Ⅱ度烫伤即为模型制备成功。

1.2.2 实验分组及干预措施:将糖尿病溃疡模型小鼠随机分为模型组和紫朱软膏组,每组各4只。制备的普通溃疡模型小鼠分为对照组。对照组和模型组小鼠给予0.9%氯化钠溶液外用换药,1次/d;紫朱软膏组予紫朱软膏换药,0.032 g/cm2,1次/d。三组均干预14 d。

1.2.3 qRT-PCR检测炎症指标及上皮-间充质转化相关因子mRNA表达:利用超纯RNA提取试剂盒提取小鼠溃疡组织样本总RNA,用反转录试剂盒反转录为cDNA,扩增后进行溶解曲线分析。按照2-ΔΔCt相对定量计算公式,计算各样品组织中炎症指标IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、iNOS及上皮-间充质转化相关细胞因子snail、β-catenin、α-SMA、E-cadherin的mRNA相对表达量。目的基因引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.4 Western blot检测上皮-间充质转化相关因子蛋白表达:利用十二烷基硫酸钠裂解小鼠溃疡组织,提取总蛋白。用考马斯亮蓝法测定各组小鼠溃疡肉芽组织样本蛋白含量,电泳后将蛋白转移到PVDF膜上,半干转膜后封闭,先后加入各观察指标相关的一抗、二抗,然后洗膜、曝光、显影,应用Image J分析灰度值。

1.3 统计学方法 本研究所有数据采用SPSS 26.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差进行描述,比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠溃疡愈合情况及创面愈合率比较 见图1。各组小鼠创面面积随观察天数增加均趋于缩小、愈合。对照组小鼠创面愈合速度较其他两组快。对照组小鼠在干预开始至7 d愈合速度较快,其他两组在干预7～11 d的愈合速度较快。干预14 d,对照组小鼠创面基本愈合,其他两组尚未完全愈合。干预11、14 d,紫朱软膏组小鼠愈合情况较模型组好。

图1 各组小鼠溃疡愈合情况

如图2所示,干预3 d,与对照组比较,模型组小鼠创面愈合率偏低(P<0.05);干预7、11、14 d,对照组小鼠的创面愈合率高于模型组(均P<0.01)。干预3、7 d,模型组、紫朱软膏组小鼠的创面愈合率比较差异无统计学意义(均P>0.05);干预11、14 d,紫朱软膏组小鼠的创面愈合率较模型组高(均P<0.01)。表明紫朱软膏能有效促进糖尿病溃疡小鼠创面愈合。

图2 各组小鼠创面愈合率比较

2.2 各组小鼠溃疡组织病理学改变 各组小鼠溃疡组织HE染色见图3。干预3 d,各组小鼠溃疡组织炎性细胞浸润明显。干预7 d,各组均见新生肉芽组织,上皮组织开始由创缘向创面中心迁移,偶见新生毛细血管,新生组织中皮脂腺等附属结构发育不完全。干预14 d,对照组小鼠创面完全被上皮细胞覆盖,肉芽平整,新生皮肤组织结构排列整齐;模型组小鼠溃疡未愈合,上皮组织未完全覆盖创面,炎性细胞浸润明显,缺乏正常排列结构和附属结构;紫朱软膏组溃疡愈合优于模型组,创面上皮组织覆盖更明显,结构更平整。

2.3 各组小鼠溃疡组织炎症因子mRNA表达比较 见表2。与对照组比较,模型组小鼠溃疡组织IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表达较高,IL-4、IL-10 mRNA表达较低(均P<0.05);与模型组比较,紫朱软膏组小鼠溃疡组织IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表达降低,IL-4、IL-10 mRNA表达升高(均P<0.05)。

表2 各组小鼠溃疡组织炎症因子mRNA表达比较

2.4 各组小鼠溃疡组织上皮-间充质转化相关细胞因子mRNA和蛋白表达比较 见表3(图4)。与对照组比较,模型组小鼠溃疡组织snail、β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表达下调,E-cadherin mRNA和蛋白表达上调(均P<0.05);与模型组比较,紫朱软膏组溃疡组织snail、β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表达上调,E-cadherin mRNA和蛋白表达下调(均P<0.05)。

图4 各组小鼠上皮-间充质转化标志物蛋白表达电泳图

表3 各组小鼠溃疡组织上皮-间充质转化相关细胞因子mRNA表达比较

3 讨 论

糖尿病足溃疡中医病名主要有“脱疽”“筋疽”等[13]。“脱疽”在《黄帝内经》中被称为“脱痈”,其曰:“发于足趾,名脱痈,其状赤黑”,记载了脱疽者局部病变特点[14]。至晋代,《针灸甲乙经》将《内经》中的“脱痈”改名为“脱疽”,这也是首次提出“脱疽”病名[15]。在后代众多医书中亦有对脱疽的记载,如《外科理例》中记载:“丁生手足,或足溃而自脱,故名脱疽”。阴虚为本病的基本病因病机,局部溃疡主要表现为瘀血、痰浊、热毒。中药油膏在糖尿病足溃疡治疗中已广泛应用,且组方以清热、活血化瘀、补虚药物为主[16-17]。紫朱软膏是通过长期临床实践总结的治疗糖尿病足溃疡的外用油膏制剂。该方由朱砂、紫草、黄芪、血竭、阿胶、冰片等组成,具有清热解毒、祛腐生肌、补益气血之效。糖尿病足溃疡早中期局部以腐肉、炎性渗出多见,治疗以“祛腐”为主,紫朱软膏具有清热解毒、祛腐生肌的作用,在祛除局部湿热毒邪同时还可祛除创面腐肉组织,改善创面炎症反应[18]。糖尿病足溃疡中后期治疗以“生肌”为主,紫朱软膏能补益气血,为创面提供营养,促进肉芽组织形成及再上皮化[12]。

上皮-间充质转化是上皮细胞转变为间充质细胞并获得增殖、迁移等表型的过程[19-20]。上皮-间充质转化目前被划分为3种亚型,其中2型上皮-间充质转化在伤口愈合、组织再生和器官纤维化发挥着重要作用[21]。在2型上皮-间充质转化中细胞骨架会重新排列,细胞间连接和顶-底极性丧失,细胞迁移、侵袭能力增强,通过快速迁移覆盖创口表面,促使创面上皮化形成表皮屏障,最终促进创面愈合[22-23]。多项研究通过检测上皮分子标志物表达如β-catenin、E-cadherin、Occludin、ZO-1等和间充质分子标志物表达如FSP1、α-SMA、N-cadherin和Vimentin等,从分子水平上证明细胞发生上皮-间充质转化改变[24-25]。上皮-间充质转化受到多种转录因子调控,如Snai1、Zeb2和Twist对EMT均具有诱导作用[26-27]。因此,促进上皮-间充质转化可能成为糖尿病足溃疡治疗的研究方向。本课题组通过在糖尿病溃疡模型上加用紫朱软膏干预,观察糖尿病溃疡愈合情况的同时,观察其对炎症细胞因子及上皮-间充质转化相关细胞因子的影响,结果发现干预11、14 d,紫朱软膏组小鼠的创面愈合率较模型组高。干预14 d,紫朱软膏组溃疡愈合优于模型组,创面上皮组织覆盖更明显,结构更平整。与模型组比较,紫朱软膏组小鼠溃疡组织IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表达降低,IL-4、IL-10 RNA表达升高。与模型组比较,紫朱软膏组溃疡组织snail、β-catenin、α-SMA表达上调,E-cadherin表达下调。以上结果提示紫朱软膏能减轻炎症反应,促进上皮-间充质转化的发生,促进糖尿病溃疡愈合。

综上所述,紫朱软膏可能通过改善创面炎症反应,诱导上皮-间充质转化,从而促进糖尿病溃疡愈合。但本课题仅观察了紫朱软膏对炎症反应及上皮-间充质转化的影响,未进一步探讨其作用机制,后期将围绕上皮-间充质转化深入探索紫朱软膏干预糖尿病溃疡的作用机制。