补肾健脾开心方对AD 大鼠自噬及凋亡相关蛋白的影响

李 莹,王 莹,孔明望

(湖北中医药大学基础医学院,武汉 430065)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种进行性神经系统退行性疾病。我国现已成为世界上AD 患者数量最多的国家[1]。AD 的病理机制复发多样,目前尚无特异性的治疗药物。自噬和凋亡在AD 的病理进展中起重要作用。自噬与AD 基本病理特点的关系密切,影响Aβ 的产生和代谢以及Tau 蛋白的组装,自噬功能失调可能加速AD 的进展[2]。失调的凋亡级联反应可以导致异常神经元丢失,且可能先于AD 病理性特征出现,与痴呆程度密切相关[3]。因此,调控细胞自噬及凋亡,已成为研究防治AD 的重要途径。

补肾健脾开心方是本课题组对《本草纲目》中益智及轻身延年药物进行分析总结,并选取其中组成唐代孙思邈《千金要方》的名方“开心散”及六味地黄丸中“三补”的药物配伍而成的自拟方。全方取先天后天互滋互用为思路,滋脾肾、开心脑、益神智,从而共同延缓AD 的进程。本课题组前期研究表明,补肾健脾开心方可有效改善AD 模型大鼠学习、记忆、认知能力[4],证实该方可明显下调AD 大鼠海马磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)的表达[5-6],影响脑皮质区凋亡[7]。但补肾健脾开心方能否通过调控自噬缓解AD 进展,方中何种治法影响自噬和凋亡尚不明确。D-gal 干预可造成大鼠脑部Aβ、Tau 蛋白的异常表达、神经元损伤[8]。本实验旨在通过D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导AD 模型探讨补肾健脾开心方是否影响自噬及凋亡,并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

70 只SPF级雄性SD 大鼠,3 月龄,体重(220±20)g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2020-0001],饲养于湖北中医药大学SPF 级实验动物中心实验室[SYXK(鄂)2022-0067],环境温度(23±2)℃,湿度(55%±5%),12 h 循环照明。用Morris 水迷宫测试其学习记忆能力,淘汰反应过于迟钝及特别敏感的大鼠4 只,自由摄食、饮水,适应性饲养1 周后开始实验。本实验获得湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准 ( HUCMS(00137435))。本实验中,动物饲养和实验过程均做到了按照实验动物使用的3R 原则给予人文关怀。

1.2 主要试剂与仪器

补肾健脾开心方由熟地20 g、山药20 g、山茱萸20 g、人参10 g、茯苓15 g、远志6 g、石菖蒲20 g 组成;补肾方由熟地20 g、山茱萸20 g 组成;健脾方由山药20 g、人参10 g、茯苓15 g 组成;开心方由远志6 g、石菖蒲20 g 组成。药物均采购于湖北中医药大学附属国医堂,经湖北中医药大学生药教研室鉴定为纯正药材。常规煎煮之后,分装备用。

D-半乳糖(美国Sigma 公司,批号:G0750);4%多聚甲醛(中国索莱宝公司,批号:P1110);二甲苯(国药集团,批号:10023418);柠檬酸(上海沪试公司,批号:10007118);BSA(北京夏末科技有限公司,批号:DX6608);一抗兔抗大鼠LC3(武汉Bioss 公司,批号:bs-2912R);一抗兔抗大鼠Beclin1(武汉Bioswamp 公司,批号:PAB35215);一抗兔抗大鼠BAX(武汉Bioswamp 公司,批号:PAB37588);一抗兔抗大鼠 Bcl-2 (武汉 Bioswamp 公司, 批号:PAB33926);二抗山羊抗兔(武汉三鹰生物技术开发公司,批号:SA00013-4); cDNA 合成试剂盒(北京夏末公司,批号:SUM73061)。

Morris 水迷宫数据自动采集系统(中国医学科学院药物研究所);旷场实验系统(成都泰盟科技有限公司);DYY-6C 型电泳仪(北京市六一仪器厂);TKD-TSF 自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司);电转仪(美国Bio-Rad 公司);BRM2235 自动切片机(德国徕卡显微系统有限公司);TB-718D 生物组织包埋机(泰维科技);DM1000 正置显微镜(德国徕卡显微系统有限公司);DMIL LED 倒置显微镜(德国徕卡显微系统有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 造模

动物适应性喂养1 周后,参照《药理学实验》[9]建立D-gal 大鼠AD 模型:将15 g 的D-gal 溶于500 mL 的0.9%生理盐水,配成30 mg/mL 质量浓度的溶液,按300 mg/kg 剂量进行腹腔注射。同时随机取10 只大鼠为空白组(Ctrl 组),注射等容积生理盐水,每日1 次,持续6 周。

1.3.2 分组与给药

取造模成功的50 只大鼠参照随机数字表分为5 组:模型组(AD 组)、补肾组(BS 组,3.6 g/(kg·d))、健脾组(JP 组,4.05 g/(kg·d))、开心组(KX组,2.34 g/(kg·d))、补肾健脾开心组(BSJPKX组,9.99 g/(kg·d)),每组10 只。BS 组、JP 组、KX组、BSJPKX 组分别以相应药物灌胃,空白组、模型组给予等容积生理盐水,每日1 次,给药4 周。

1.3.3 Morris 水迷宫测试

定位航行测试为实验前1~5 d:记录大鼠从不同象限入水到爬上平台并停留超过10 s 所需的时间(即逃避潜伏期),连续5 d,每次测试120 s。空间搜索实验为第6 天:第6 天撤除平台,记录动物跨越原平台的次数,测试时长120 s。

1.3.4 旷场实验

水迷宫实验结束后1 d,将单只大鼠放置于旷场实验生物数据采集系统实验箱中心区域,记录其自由活动情况,记录时间为6 min,记录内容主要为其运动距离和中心区域的运动时间。

1.3.5 蛋白印迹法(Western blot)

行为学测试结束,麻醉大鼠,每组取3 只生理盐水心脏灌注,将脑皮质组织于冰上迅速取样,约20 mg,剪碎后加入裂解液匀浆,12 000 r/min,4℃,离心15 min 取其上清。各组样品蛋白浓度通过BCA法(bicinchoninic acid)测定后将其调为一致浓度。经10% SDS 聚丙烯酰胺(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶电泳分离,聚偏二氟乙烯膜转膜,5%脱脂奶粉于室温封闭1.5 h。分别加入一抗(β-actin:1 ∶500,Beclin1:1 ∶1000,LC3:1 ∶1000)4℃孵育过夜。次日滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶10 000)37℃孵育1.5 h。加入增强型化学发光试剂显色底物后,按常规X 线片显影方法显影。Image J 图像分析软件对样品条带的灰度值进行数字化分析。以β-actin 为内参蛋白。

1.3.6 免疫组化

行为学测试结束,麻醉大鼠,每组取3 只多聚甲醛心脏灌注,取脑皮质组织,石蜡包埋切片(厚度4 μm)。免疫组织化学染色检测脑皮质B 淋巴细胞瘤-2(B 淋巴细胞瘤-2,Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)的表达,组织中棕黄色或棕褐色颗粒为目标蛋白。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸抗原修复、0.5%牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)湿盒孵育30 min 后,Bax 抗体(1 ∶100)、Bcl-2 抗体(1 ∶200)滴加覆盖组织块,4℃孵育12 h,二抗孵育30 min,再经DAB 染色、苏木素复染、脱水、树脂封片后,显微镜采集图像。每张片子随机选取3 个视野(×200),采用Image J 软件分析光密度,取其平均值。

1.3.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

行为学测试结束,每组随机取7 只大鼠断头处死,冰上迅速取脑皮质组织,使用TRIzol 试剂从脑组织中提取总RNA。用cDNA 合成试剂盒从1 μg总RNA 中合成cDNA。采用SYBR qPCR Mix 在Bio-Rad CFX Connect Real-time System 上进行实时定量PCR。qRT-PCR 条件为:95℃,10 min。靶基因的相对表达以GAPDH 为内参进行归一化,以2-ΔΔCT方法计算倍数变化。使用的引物序列如下:Beclin1正向引物序列(5’ -3’):GAATGGAGGGGTCTAA GGCG 和反向引物序列(5’-3’):CTTCCTCCTGG CTCTCTCCT;P62 正 向 引 物 序 列(5’ - 3’):TCCTGCAGACCAAGAACTATGACATCG 和反向引物序 列( 5’ - 3’): TCTACGCAAGCTTAACACAA CTATGAGACA;Bax正 向 引 物 序 列(5’ - 3’):TTGCTACAGGGTTTCATCC 和反向引物序列(5’-3’):GTCCAGTTCATCGCCAAT;Bcl-2 正向引物序列(5’-3’):CAGAATCAAGTGTTCGTCAT 和反向引物序列(5’-3’):AGTCTTCATCTCCAGTATCC;GAPDH正向引物序列(5’-3’):CAAGTTCAA CGGCACAG和 反 向 引 物 序 列 ( 5 ’ - 3 ’): CCAGTA GACTCCACGACAT。

1.4 统计学方法

本实验采用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理,用Graphpad Prism 8 绘制统计图。数据计算使用平均数±标准差(±s)。符合正态分布的多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较

如图1 所示,在定位航行实验中,逃避潜伏期随着各实验动物累积训练时长的不断增加,其总体趋势显示下降。开始训练前2 d,各组实验动物间逃避潜伏期未见显著差异(P＞0.05)。与Ctrl 组比较,从第3 天开始,AD 组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.01)。与AD 组比较,如图1 所示从第3 天开始至实验结束,BS 组、JP 组、KX 组、BSJPKX 组4 组大鼠逃避潜伏期显著缩短(P＜0.01)。与BSJPKX 组比较,在实验第3 天与JP 组之间有明显差异(P＜0.01);在实验第4、5 天,BS 组、JP 组、KX 组3 组大鼠逃避潜伏期较长,且与之有明显差异(P＜0.01)。

注:与Ctrl 组比较,**P＜0.01;与AD 组比较, ##P＜0.01;与BSJPKX 组比较, &&P＜0.01。图1 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期(n=10)Note.Compared with Ctrl group, **P＜0.01.Compared with AD group, ##P＜0.01.Compared with BSJPKX group, &&P＜0.01.Figure 1 Incubation period of experimental evasion by positioning navigation for each group of rats

如图2 所示,在空间探索实验中,与Ctrl 组比较,AD 组大鼠在水池中隐藏平台撤除后,找到并穿越原平台象限的次数明显减少(P＜0.01);与AD 组比较,BS 组、JP 组、KX 组、BSJPKX 组跨越原平台次数明显升高(P＜0.01);与BSJPKX 组比较,BS 组找到并穿越原平台象限的次数与之有明显差异(P＜0.01),JP 组、KX 组找到并穿越原平台象限的次数与之无明显差异(P＞0.05)。

注:与Ctrl 组比较,**P＜0.01;与AD 组比较,##P＜0.01;与BSJPKX组比较,&&P＜0.01。图2 各组大鼠空间探索实验跨越平台次数(n=10)Note.Compared with Ctrl group, **P＜0.01.Compared with AD group,# #P＜0.01.Compared with BSJPKX group,&&P＜0.01.Figure 2 Number of spatial exploration experiments across platforms for each group of rats

2.2 各组大鼠认知功能比较

如图3 所示,与Ctrl 比较,发现AD 组大鼠其旷场实验测试数据中总运动距离以及大鼠于中心区域运动时间的比率明显下降(P＜0.01)。与AD 组比较,BS 组、JP 组、KX 组、BSJPKX 组各组大鼠旷场实验测试数据中运动距离和中心区域运动时间比率上调(P＜0.05)。与BSJPKX 组比较,BS 组大鼠旷场实验测试数据中运动距离和中心区域运动时间比率无明显差异(P＞0.05);JP 组大鼠运动距离和中心区域运动时间比率有明显差异(P＜0.01);KX 组大鼠运动距离有明显差异(P＜0.05),中心区域运动时间比率无明显差异(P＞0.05)。

注:与Ctrl 组比较,**P＜0.01;与AD 组比较,#P＜0.05,##P＜0.01;与BSJPKX 组比较,&P＜0.05,&&P＜0.01。图3 各组大鼠旷场试验比较(n=4)Note.Compared with Ctrl group,**P＜0.01.Compared with AD group,# P＜0.05,##P＜0.01.Compared with BSJPKX group,& P＜0.05,&&P＜0.01.Figure 3 Comparison of open-field tests for each group of rats

2.3 各组大鼠脑皮质Beclin1、LC3-I、LC3-II 蛋白表达比较

如图4 所示,与Ctrl 组相比,AD 组Beclin1、LC3-I/LC3-II 比值显著下调(P＜0.01)。与AD 组比较,BS 组、JP 组Beclin1 上调(P＜0.01),LC3-I/LC3-II 比值无明显回升(P＞0.05);KX 组、BSJPKX 组Beclin1、LC3-I/LC3-II 比 值 增 加(P＜0.01)。与BSJPKX 组比较,BS 组、JP 组、KX 组Beclin1、LC3-I/LC3-II 比值表达量有明显差异(P＜0.01)。

2.4 各组大鼠脑皮质Bax、Bcl-2 蛋白表达比较

如图5 所示,与Ctrl 组相比,AD 组Bax 增多(P＜0.01),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比 值 明 显 降 低(P＜0.01)。与AD 组比较,BS 组、JP 组、KX 组、BSJPKX组Bax 下调(P＜0.01),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值上调(P＜0.01)。与BSJPKX 组比较,BS 组Bax、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值无明显差异(P＞0.05);JP 组Bax、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值有明显变化(P＜0.01);KX组Bax 无明显差异(P＞0.05),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值有显著差异(P＜0.01)。

2.5 各组大鼠脑皮质Beclin1、P62、Bax、Bcl-2 基因表达比较

如图6 所示,与Ctrl 组相比,AD 组Beclin1、Bcl-2 明显降低(P＜0.01),P62、Bax增多(P＜0.01)。与AD 组比较,BS 组、JP 组、KX 组、BSJPKX 组Beclin1、Bcl-2 比值上调(P＜0.05),P62、Bax下调(P＜0.05)。与BSJPKX 组比较,BS 组Beclin1、Bax、Bcl-2 无明显差异(P＞0.05),P62 有明显差异(P＜0.05);JP 组Beclin1 无明显差异(P＞0.05),P62、Bax、Bcl-2 有明显变化(P＜0.05);KX 组Beclin1、P62 无明显差异(P＞0.05),Bax、Bcl-2 有明显差异(P＜0.01)。

注:与Ctrl 组比较,**P＜0.01;与AD 组比较,#P＜0.05,##P＜0.01;与BSJPKX 组比较,&P＜0.05,&&P＜0.01。图6 各组AD 大鼠脑皮质Beclin1、P62、Bax、Bcl-2 mRNA 水平(n=7)Note.Compared with Ctrl group,**P＜0.01.Compared with AD group, #P＜0.05,##P＜0.01.Compared with BSJPKX group, &P＜0.05,&&P＜0.01.Figure 6 Cortical relative mRNA levels of Beclin1, P62, Bax and Bcl-2 in AD rats of all groups

3 讨论

AD 目前治疗方法有限,多数为缓解其临床症状,延缓病理进展。中医药防治AD 有其独特的优势,多种单药提取物或多药联合运用可以延缓AD病理进展,防治痴呆[10-12]。本课题组从《本草纲目》益智及轻身延年药物中发现,归心、脾、肾三经的药物占重要比例。选取其中开心散的组成药物石菖蒲、远志、人参、茯苓及六味地黄丸三补药物熟地、山药、山茱萸组成自拟方,依据其功效取名为补肾健脾开心方。石菖蒲补肾健脑益智开窍,远志补肾通心,人参补五脏首入脾,茯苓补心通肾,熟地滋阴补肾,山茱萸以补养肝肾,山药以补益脾阴固肾。补肾健脾开心方,补肾健脾,取先天后天互滋互用,滋脾肾、开心脑、益神智。本课题组前期研究表明,补肾健脾开心方可有效改善AD 模型大鼠学习、记忆、认知能力[4],证实该方可明显下调AD 大鼠海马PI3K、Akt 的表达[5-6],影响脑皮质区凋亡[7]。但本方中何种治法影响自噬和凋亡尚不明确,因此依据药物归经及功效,对补肾健脾开心方进行拆分,将同归于肝、肾两经的熟地、山茱萸组成补肾方;将同归于脾经的山药、人参、茯苓组成健脾方;将同归于心经的远志、石菖蒲组成开心方,以观察补肾、健脾、益智治法及补肾健脾开心方全方对AD 的治疗作用,并探讨其可能的作用机制。

细胞凋亡和自噬是维持生物体稳态和促进生存的重要细胞内过程。细胞凋亡和自噬的不平衡与神经退行性疾病有关[13]。恢复自噬和细胞凋亡之间的平衡是治疗AD 的有希望的策略。现代研究表明,补肾健脾开心方中多味药物的活性成分可影响细胞自噬、抑制凋亡[14-17],但是目前尚未有报道研究补肾健脾开心方全方合用及其拆方对脑皮质区自噬及凋亡的影响。本研究利用D-gal 诱导的AD 大鼠模型,研究补肾健脾开心方对AD 的作用及其机制。结果表明,AD 组大鼠学习记忆能力明显下降,微管相关蛋白1 轻链3II(LC3-II)、Beclin1、Bcl-2 表达减少,Bax 表达增加,提示AD 大鼠模型建立成功。

自噬是由溶酶体介导,可以清除细胞内异常折叠的蛋白质和衰老或受损的细胞器,从而维持细胞稳态的一个高度保守的分解过程,[18]。AD 动物模型研究发现,自噬可以清除神经元细胞内Aβ 沉积和可溶性Tau 蛋白以及NFTs 聚合物[19]。LC3 被广泛用于监测自噬。在自噬开始时,LC3-I 转化为LC3-II,并且LC3-II 随着自噬的进展而消失,LC3-II的数量与自噬囊体的数量明显相关[20]。此外,自噬诱导的一个关键因素是Beclin1 蛋白,亦在自噬的启动中起着核心作用[21]。本研究发现补肾健脾开心方可明显提高AD 大鼠脑皮质区LC3-II、Beclin1 表达,提示补肾健脾开心方可能通过激活脑神经元细胞自噬,缓解D-gal 诱导的AD 大鼠减轻学习记忆能力障碍和认知行为缺陷。拆方实验结果显示,开心组较补肾组及健脾组更明显地激活自噬,提示补肾健脾开心方中对影响细胞自噬起重要作用的药物可能为远志和石菖蒲。

细胞凋亡涉及到多种分子和细胞机制,是细胞死亡的机制之一[22]。在AD 早期阶段发现了神经元凋亡,并且在AD 患者的尸检中也显示出大量脑凋亡神经元[23-25]。Bcl-2、Bax 是一对经典的凋亡靶蛋白,二者在被激活或抑制的不同情况下发挥其相应的生物学效应。具体来说,Bax 增强线粒体的通透性,激活细胞凋亡;Bcl-2 通过结合Bax 形成复合物,降低Bax 诱导的线粒体通透性,抑制细胞凋亡[23]。因此,Bcl-2/Bax 值的动态改变反映细胞凋亡状态变化,若Bcl-2/Bax 值增大,则表明细胞凋亡的抑制作用明显;反之,则促进凋亡。本研究发现补肾健脾开心方可明显逆转Bcl-2、Bax 水平的失调,引发Bcl-2/Bax 值变化,提示补肾健脾开心方可以抑制AD 大鼠脑皮质区细胞凋亡。此外,拆方实验结果显示,补肾组较健脾组及开心组更明显地抑制凋亡,提示补肾健脾开心方中对影响细胞凋亡起重要作用的药物可能为熟地和山茱萸。

自噬和凋亡在发育和细胞稳态中起重要作用[25]。异常的自噬和凋亡是神经元细胞损伤的先决条件因素[26]。因此,保持自噬和细胞凋亡之间的平衡对于细胞至关重要,特别是对于神经元等细胞。研究表明自噬和细胞凋亡之间存在相互作用的分子机制,如Bcl-2[13]。Bcl-2 是一种公认的抗凋亡因子,通过与Beclin1 结合来抑制自噬[27]。此外,Bcl-2 可以与Bax 相互作用以抑制细胞凋亡[28]。Bcl-2 在Ser70 上的磷酸化可破坏Bcl-2-Beclin-1 复合物以促进自噬,并稳定Bcl-2-Bax 相互作用以抑制细胞凋亡[29]。本研究发现补肾健脾开心方可明显促进Beclin1 和Bcl-2 的表达,抑制Bax,提示补肾健脾开心方可以维持自噬和细胞凋亡之间的平衡。此外,拆方实验结果显示,开心组较补肾组及健脾组更明显地激活自噬,而补肾组较健脾组及开心组更明显地抑制凋亡,提示补肾健脾开心方合方使用才是维持细胞自噬和凋亡平衡的关键。

综上所述,补肾健脾开心方配伍使用可以明显改善D-gal 诱导的AD 大鼠的学习记忆能力,其机制可能与激活神经自噬、抑制细胞凋亡有关。