骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及其在关节软骨损伤修复中的相关应用

刘少斐,许冰冰

(1.北京四中国际课程佳莲校区,北京 102202;2.北京大学第三医院运动医学研究所膝关节外科,北京 100083)

关节软骨主要由软骨细胞、软骨前体细胞、Ⅱ型胶原纤维和蛋白聚糖等组成,是关节腔内覆盖在滑膜上直接接触关节骨端的一种透明软骨[1]。关节软骨本身缺乏血管、淋巴和神经,自身修复能力有限,外界创伤、关节损伤或是其他疾病导致的软骨损伤一般无法自行痊愈,因此,需要对损伤的软骨进行及时治疗。常见的治疗方法根据软骨的退变程度可分为三类:姑息治疗、修复治疗和再生治疗[2-4]。

近年来,干细胞治疗为软骨损伤的修复提供了一种具有前景的治疗策略,治疗的关键就是要保证软骨细胞的正常分化或诱导分化[5]。干细胞是指具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,在一定条件下,它们可以在体内分化成多种成体细胞[6]。干细胞治疗主要是指将干细胞输送到身体的特定部位,以期修复病灶或受损的组织。近年来,许多临床实验证明,利用干细胞的自我更新和软骨分化能力,可以有效的治疗软骨损伤[7-8]。骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作为传统干细胞的一种,由于其取材简单、增殖能力强、引起免疫应答能力弱、分泌生长因子(如血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等)以及自我更新能力强等特点,能够通过体外培养、扩增获得足够数量的细胞,从而广泛的应用在软骨修复治疗中[7-8]。

因此,本文就近年来对骨髓间充质干细胞提取方法、表面鉴定、多向分化能力及其在软骨修复中的应用进行阐述,并对其未来的应用进行展望。

1 骨髓间充质干细胞的提取

骨髓间充质干细胞是一种长梭形的非造血细胞,主要来源于中胚层,在特定的分化条件下,可以分化成不同的组织(如骨骼、软骨、脂肪等)[9-10]。骨髓间充质干细胞主要取自骨髓,根据骨髓间充质干细胞的生物特性,可以采用骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法和流式细胞仪器进行分选,下面对每种方法进行简要介绍。

(1)骨髓贴壁培养法

主要是根据细胞的贴壁性进行区分,通过固定时间间隔更换培养基来去除不贴壁的细胞,主要包括血细胞(如红细胞、白细胞、造血细胞等)。骨髓贴壁培养法具有操作简单、经济实惠等优点,但是该方法获得的骨髓间充质干细胞成分比较复杂、纯度较低。

(2)密度梯度离心法

主要是根据细胞的大小和密度进行分选。该方法先用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)等体积稀释骨髓血,再将稀释后的骨髓血与等体积的 Ficoll 淋巴分离液通过梯度离心(3000 r/min,15 min)获得不同类型的沉淀液。不同细胞根据其密度的差异分布在不同的高度上,红细胞以及多核细胞位于最底层(1.08 g/mL),淋巴细胞分离液(1.08 g/mL)位于倒数第二层,骨髓间充质干细胞、造血干细胞等单核细胞位于第二层(1.05~1.08 g/mL),而血浆及其溶解物处于最高层(1.05 g/mL)[11]。第二层为单核细胞层,该层细胞在颜色和形状上呈现出灰白色云雾状,在实际分离过程中,可根据操作的熟练程度,直接吸取第二层;或先去除第一层,再吸取第二层。将吸取的白色云雾状液体,用PBS 洗涤后,倒入培养瓶中进行培养。通过骨髓贴壁培养法,进一步分离骨髓间充质干细胞。目前,由于梯度离心法为非破坏性分析,且操作简单性、可扩展性强,从而广泛应用于实验室高纯度BMSCs 的分离。

(3)流式细胞仪器分选

主要是根据不同细胞的表面标志物进行分选。利用电场的作用力分离细胞,通过标记多个表面标志物甚至是细胞内标准物对细胞进行识别。尽管这种方法获得的BMSCs 纯度更高,但分选时间长、效率低,因此,在临床实验中该方法未得到普及。

2 骨髓间充质干细胞的多向分化能力

提取纯化后的骨髓间充质干细胞,需要进行细胞分化能力的表征鉴定。常用的方法为利用流式细胞仪对细胞表型进行鉴定以及对细胞进行三系分化诱导。

骨髓间充质干细胞在流式细胞仪中,一般表现为CD29、CD44、CD71、CD90、CD105 和CD106 阳性以及CD3、CD4、CD14、CD34 和CD45 阴性。其中成软骨潜力与CD105 有关,该表型为转化生长因子β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)的一个受体[12],这意味着通过与TGF-β3 相互作用,CD105 在软骨组织的再生和修复过程中可能起到重要的调控作用。此外CD146 作为与成骨潜能密切相关的标记物在BMSCs 中被广泛表达,即在骨组织的再生和修复过程中,BMSCs 可以分化为骨细胞,参与骨组织的生成和修复。

骨髓间充质干细胞三系诱导分化是指通过特定的培养条件,将骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。这一过程需要在特定的时间点添加多种刺激和抑制因子,这些因子在特定细胞类型分化的前期和末期发挥着重要的作用[13]。成骨诱导主要是将处于生长旺盛期的骨髓间充质干细胞接种于预埋了0.1%明胶的6 孔细胞培养板上,同时加入2 mL 完全培养基,待细胞融合60%~70%后,去除6 孔细胞培养板中的完全培养基,同时加入2 mL 成骨诱导分化完全培养基(10%胎牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸酯和50 μmol/L 抗坏血酸)。定时换液,在诱导3 周后,使用茜素红进行染色,并利用显微镜观察染色情况。研究报道,Runt 相关转录因子2(Runtrelated transcription factor 2,Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)和β-连环蛋白(β-catenin)在成骨诱导分化中发挥举足轻重的作用[14-17]。成脂肪诱导是将处于生长旺盛期的骨髓间充质干细胞接种到6 孔板中,每孔加入2 mL 完全培养基并且定时换液,等到细胞融合度达到100%或者过融合时,去除孔内的培养基,并向每孔加入2 mL 成脂诱导分化培养基A 液(1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 甲基异丁基黄嘌呤、10 μg/mL 胰岛素、100 mmol/L 吲哚美辛和10% 胎牛血清)。诱导3 d 后,吸走6 孔板中的A 液,加入2 mL 带10 μg/mL 胰岛素和10%胎牛血清的成脂诱导分化培养基B 液。B 液作用24 h 后,吸走B 液,换回A 液进行诱导。如此循环3~5 次,继续用B 液维持培养4~7 d 直到脂滴变得足够大、足够圆。B 液维持培养期间,每隔2~3 d 需要更换新鲜的B 液,21 d 后,通过油红O 染色评估细胞质内脂质空泡的形成情况。在成脂分化过程中,主要参与的转录因子有miR-17、miR-21 和miR-143[18]。成软骨诱导分化与上述两种分化的主要差异在于对细胞的悬浮培养。取生长旺盛的细胞置于离心管中,用0.5 mL 间充质干细胞成软骨诱导完全培养基重悬,室温下150 r/min 离心5 min(拧松离心管管盖以便于气体交换),后将其放置于37℃,5% CO2的培养箱中培养。当细胞团出现聚拢现象时,轻弹离心管底部使软骨球脱离管底,悬浮在液体中。定时更换培养基,诱导21~28 d 后,对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片,最后进行阿利辛蓝染色。成软骨分化中,性别决定Y 染色体区域(SRY)相关的高迁移率族盒基因9(Sox9)[19-20]以及锌指蛋白145(ZNF145)[21]等都是起到关键作用的主要转录因子。

3 骨髓间充质干细胞在关节软骨缺损修复中的应用

基于骨髓间充质干细胞的软骨缺损修复应用,主要分为两类:一类是直接将骨髓间充质干细胞注射到软骨损伤中,通过注射,干细胞可以促进软骨细胞的增殖和分化,并为损伤区提供细胞修复所需的生物因子和生长因子。该方法可以将干细胞通过局部注射的方式,直接输送到软骨缺损处,具有简单、非侵入性的特点,在临床应用中较为方便。另外一类则是通过组织工程软骨的递送系统,利用水凝胶等生物材料包裹干细胞,将材料移植到软骨缺损处。递送系统具有良好的生物相容性和可塑性,可以提供支架结构和细胞定位,在移植后,骨髓间充质干细胞可以逐渐分化为软骨细胞,并与材料共同促进软骨组织的再生和修复。这种方法可以根据缺损的大小和形状,精确定位和定制支架,为软骨修复提供更好的结构和功能重建。

由于提取骨髓间充质干细胞的治疗侵入性小,且能够降低发病率和手术成本,因此骨髓间充质干细胞的临床前验证得到了众多学者的广泛关注。Maeda 等[22]通过体外细胞实验验证BMSCs 制造的圆盘形细胞薄片具有较好的成软骨性能。Al Faqeh等[23]和Ude 等[24]通过山羊的骨关节炎动物模型,发现在关节腔内注射干细胞可以促进软骨再生。此外,比格犬、猪等大型动物[25-26]以及兔子、小鼠[27-28]等小型动物的关节腔注射动物实验结果也表明,骨髓间充质干细胞有利于软骨修复。Li 等[29]将不同来源的间充质干细胞负载到脱钙骨支架并研究其软骨分化潜力,结果发现利用BMSCs 修复软骨缺损,其修复组织在细胞形态和染色特性方面的表现超过了其他来源(如骨膜、脂肪、滑膜和肌肉等)的干细胞(P＜0.05)。Nejadnik 等[30]将72 名病情类似的患者随机分成两组,对两组患者分别使用软骨细胞和骨髓间充质干细胞进行修复,结果发现BMSCs 移植在缓解疼痛和提高患者生活质量方面与软骨细胞同样有效,且与患者的年龄无关。尽管目前BMSCs 的采集相对简单且具有低免疫原性,但直接注射BMSCs 仍存在一定的问题,例如注射过程剪切力和局部缺氧等问题导致注射过程细胞死亡率较高、细胞在病灶区粘附力弱和细胞扩散等问题导致干细胞无法在病灶区长时间停留等。

软骨组织工程是利用生物材料作为递送系统进行修复,以水凝胶等生物材料作为支架,通过支架模仿细胞外基质,利用支架复合细胞,将支架-细胞复合物移植到软骨损伤区。自体软骨替代物的产生和软骨缺陷新治疗策略的开发是组织工程软骨领域的重大挑战。通过使用支架为细胞生长提供一个三维空间,有利于种子细胞的存活,同时避免有害微环境的影响。目前,常见的支架材料主要分成两类:一类是自然材料,另外一类是合成材料。自然材料(如去细胞基质、胶原蛋白、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐等)生物相容性好,可降解,但强度偏低。合成材料(高分子材料(聚乳酸、聚乙二醇)、水凝胶材料(甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸明胶)等)来源广、强度高,但可能存在潜在的排异反应。

目前,软骨组织工程中常用BMSCs 和水凝胶相结合的治疗方法,基于免疫调节和抗炎作用相关的“医学信号细胞”特性,在受伤组织中诱导再生微环境的建立。Feng 等[31]首先合成了巯基明胶和乙烯基磺化透明质酸,并通过微流道法将其与骨髓间充质干细胞混合后注射至软骨损伤部位,结果发现,细胞在水凝胶材料中具有较高的活性、增殖能力和分化能力,这种可注射的自组装负载干细胞的水凝胶能够实现简单有效的软骨修复。Abdul Rahman等[32]以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-coglycolic acid),PLGA)/纤维蛋白构建了一个三维支架,将细胞接种于三维支架上有利于细胞成软骨分化。Liu 等[33]通过3D 打印技术,利用甲基丙烯酸透明质酸(methacrylated hyaluronic acid,MeHA)/聚己酸内酯打印了复合BMSCs 的多层支架,其中MeHA 用于负载干细胞,双氯芬酸钠用于抑制炎症反应,结果显示,负载BMSCs 的支架有利于促进二型胶原表达和抑制白细胞介素1 表达,进一步说明利用BMSCs 复合支架能够有效的避免关节内炎症反应并促进软骨修复。Erickson 等[34]研究表明,在体外植入BMSCs 的透明质酸水凝胶可以改善软骨修复。Ansboro 等[35]将拟软骨的透明质酸微球用作诱导BMSCs 软骨形成的生长因子传递源,负载TGF-β3 的微球孵育生长的BMSCs 增强了软骨相关糖胺聚糖的积累,并且II 型胶原蛋白和蛋白聚糖的阳性染色证实了体外软骨的形成;体内植入实验同时也发现组织中蛋白聚糖表达的增加。Meng 等[36]设计了一种由亲和肽修饰的脱矿质骨基质颗粒与壳聚糖水凝胶结合的复合支架用于软骨工程,这种支架具有适当的孔隙率,并为细胞粘附和增殖提供了微环境,能够改善BMSCs 体外软骨分化的能力,可用于不规则形状软骨缺陷的修复。在临床软骨修复中使用BMSCs 可以避免自体软骨细胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)的局限性。在过去的10 年中,BMSCs 用于治疗软骨缺损的植入方法取得了与第一代ACI 相当的临床结果。此外,这种治疗方法并没有显著增加肿瘤形成的风险[37]。

4 小结与展望

目前,大量的研究人员就骨髓间充质干细胞在软骨修复中的应用进行了丰富的研究。动物实验和临床试验研究结果表明,利用骨髓间充质干细胞能够较好的实现对软骨的修复,干细胞软骨治疗具有较好的发展前景。

尽管干细胞疗法为软骨损伤修复应用开辟了新途径,但移植后干细胞的存活率普遍较低。因此,研究如何支持干细胞的存活、促进细胞生物活性以及增强细胞与周围环境的结合,对于提高治疗效果具有重要的意义。另外,与细胞外基质类似的水凝胶材料作为递送干细胞的载体已经得到了广泛的研究。目前,实现软骨完全恢复到其原始的组成、结构、力学性能和生物功能仍然是一个重大的挑战。例如,同时实现整合软骨和软骨下骨再生已成为组织工程学中的关键挑战。同时,在考虑软骨修复过程中,还需要考虑软骨下骨修复,在组织工程支架设计上应仔细考虑两种不同类型组织的结构和模量差异。对于软骨修复部分,需要支架表现出高弹性模量以承受压力并抵抗摩擦,同时增强BMSCs 的软骨形成,抑制肥大分化。软骨下骨修复部分,则需考虑促进水凝胶内血管网络的形成能力,以促进营养物质的运输,刺激成骨细胞的增殖并为再生软骨提供强大的支持。另外还需考虑,植入物与周围软骨界面粘附力,提高组织工程软骨的植入成功率。

在未来,随着科技的进一步发展,随着问题的逐一解决,将能够实现利用骨髓间充质干细胞精准、高效地修复软骨损伤。