血清miRNAs作为诊断胰腺癌新型生物标志物的研究进展

朱徽胤 李驰 葛毅 夏佳琪

胰腺癌是消化系统中常见的恶性程度较高,预后较差的肿瘤之一[1]。预计到2030年,胰腺癌将成为全球癌症相关死亡的第二大常见原因[2]。胰腺癌根据发生部位进行分类,分为外分泌源性胰腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤(PNETs)[3],大约95%的外分泌源性胰腺癌最常见的是胰腺导管腺癌(PDAC)[4],胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)是胰腺导管腺癌(PDAC)发生的前兆[5]。若能在发生PDAC前诊断出IPMN便可及时预防和阻止PDAC的进一步转移或侵袭。胰腺导管腺癌的近5年生存率极低,为3%～5%[1]。由此可见胰腺癌的分类分析对其早期诊断有重大意义。80%～85%的患者在诊断时出现局部晚期或转移性不可切除的胰腺癌,由于缺乏准确的检测测试,目前尚不清楚哪种单独测试或联合测试最适合诊断胰腺癌,在早期阶段检测胰腺癌仍然是一个巨大的挑战[6]。胰腺癌的诊断依赖于影像学检查方式,如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和内镜超声(EUS),但这些检查与组织采集一起使用[7]。血清癌抗原19-9(CA19-9)是美国食品药品监督管理局批准用于胰腺癌常规治疗的惟一标志物[8],但由于其敏感性低,无法满足实践中的临床诊断需求[9]。CA19-9的低阳性预测值意味着其在无症状患者的大规模筛查中无显著作用,仅适用于监测治疗反应和作为疾病复发的标志物[10]。所以急需要找出更加准确的临床治疗诊断标志物。

1 血清miRNA

miRNAs是一种由18～22个核苷酸组成的非编码RNA分子,在肿瘤发生和转移中发挥重要作用[11]。由于其重要的生物学功能,miRNAs是一类有应用前景的新型生物标志物,可用于诊断重大疾病,并监测疾病进展[12]。许多在调节细胞凋亡中起作用的miRNA也与各种肿瘤过程的启动和进展有关[13]。利用血清和体液中的miRNAs显著稳定性[14]以及疾病条件下miRNAs的表达失调,许多研究已经提出miRNAs作为诊断和预后生物标志物[15]。更有研究证明了血清中miRNA的水平是稳定的,可重复的,并且在同一物种的个体之间是一致的,还确定了血清miRNA对肺癌、结直肠癌和糖尿病的特定表达模式,并通过一系列的分析得知血清miRNA可以作为检测各种癌症和其他疾病的潜在生物标志物[16]。基于血清miRNA的生物标志物将使全面分析肿瘤成为可能[17]。

2 血清miRNA在胰腺癌中的研究

大量研究证实血清中miRNA的异常表达与胰腺癌密切相关。Mao等[18]发现血清miRNA let-7a水平可为胰腺癌的诊断和术后监测提供参考。Zou等[19]在胰腺癌患者血清中鉴定出六种显着上调的miRNA:let-7b-5p,miR-192-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-223-3p和miR-25-3p。Liu等[17]在血清中展示了7种miRNA(miR-20a,miR-21,miR-24等)可能是胰腺癌诊断的一种新的无创方法。Wei等[20]发现血清miR-1290和miR-1246可能是胰腺癌诊断的有希望的生物标志物。Shi等[21]研究发现血清miR-629可以有效地从健康对照中筛查胰腺癌患者(AUC=0.765),表明血清miR-629可能是胰腺癌诊断和预后的潜在生物标志物。血清miRNA作为肿瘤诊断和预后分子标志物不仅具有创伤小、方法准确、便捷的优势而且还可改进疾病诊断、肿瘤分类、预后估计、疗效及复发预测的精度[22],所以本研究总结了它们在各亚型中现有的作用,以便为未来研究血清miRNA在具体某一类胰腺癌中起到早期诊断作用而提供便利。

3 血清miRNA作为胰腺癌诊断标志物

3.1 血清miRNA作为胰腺导管腺癌诊断标志物 胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺癌类型,是癌症相关死亡的主要原因[23]。在临床实践中,早期发现PDAC仍然是一个挑战,寻找更敏感的诊断生物标志物对早期检测PDAC和预测侵袭或转移具有重要意义[24]。尽管此前在PDAC中已经发现了数千种miRNA,但对其临床价值的研究相对不够[25]。更准确的miRNAs生物标志物应有助于PDAC早期诊断,有助于区分预期寿命长或短的患者,从而允许更有针对性的治疗方法[26]。

Jiang等[25]研究了miR-607在PDAC组织和血清样本中的临床意义,ROC曲线分析显示,miR-607(AUC=0.785)比CA19-9和CEA更能区分PDAC患者和健康对照组。但值得注意的是,miR-607、CA19-9和CEA联合使用的诊断价值优于单独使用,凸显miR-607可能是诊断PDAC的潜在生物标志物,且术后PDAC患者血清miR-607表达增加确定miR-607作为预后生物标志物。

Wang等[27]收集了PDAC患者、健康个体和良性胰腺病变患者共13份血清样本,高通量分析PDAC中miRNA表达模式的改变,通过qRT-PCR分析候选血清外泌体miRNA的进化和验证,发现miR-1226-3p(AUC=0.74)在预测PDAC方面具有可接受的性能,是诊断和预测PDAC肿瘤侵袭或转移的潜在生物标志物。还发现与PDAC相比,胰腺良性病变患者血清外泌体miRNA-1226-3p的表达显著升高,提示miRNA-1226-3p可能是PDAC患者和胰腺良性病变患者之间分化的生物标志物。

Ada等[28]的研究发现一系列血清miRNAs对PDAC的早期诊断和预后有潜在的帮助,通过利用微阵列芯片分析2 549个miRNA,在血清中鉴定哪些是能够诊断早期PDAC的miRNA。发现miR-4516在PDAC中表达上调,对miR-4516进行了qRT-PCR验证,结果表明PDAC与健康对照组之间miR-4516差异有统计学意义(P=0.0330)。通过使用DAVID网络工具对假定靶点进行KEGG通路分析发现其假定的靶点包括一系列参与癌症进展和传播的关键途径的基因,证实了差异表达的血清miR-4516参与了PDAC的发病机制。

Huang等[29]使用TCGA和GEO数据库分析miR-429的表达和预后价值,与健康志愿者相比,PDAC患者血清中miR-429水平有所下降,这表明miR-429可能作为PDAC的血清诊断标志物,还发现miR-429抑制PDAC细胞增殖、侵袭和迁移,这支持其在PDAC中潜在的肿瘤抑制作用。此外,7种低水平表达的循环miRNAs(hsa-miR-6126、hsa-miR-2392、hsa-miR-4327、hsa-miR-939-5p、hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-313-5b)仅在PDAC患者血清中被发现,而在健康对照组中未发现,这表明它们可能作为该癌症类型的新兴生物标志物[28]。

3.2 血清miRNA作为胰腺导管内乳头状黏液肿瘤诊断标志物 PDAC前体病变有两种类型,即胰腺上皮内肿瘤和黏液性囊肿,后者又进一步细分为胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMNs)和黏液性囊性肿瘤(MCNs),特别是IPMN有很高的发展为PDAC的潜力,因此具有很高的临床相关性[30]。Zhang等[30]发现了有效区分健康个体和恶性IPMN患者的生物标志物,并表明它们可能对早期无症状PDAC的检测有用。因此在PDAC发生前对于IPMN的检测和诊断是很有必要的,且得到敏感性和特异性更高的血清miRNA作为IPMN早期诊断标志物具有重大临床意义。

Goto等[31]在研究中就提到有关的血清miRNA是有潜力成为诊断IPMN的生物标志物。他们对PDAC患者(n=32)或IPMN患者(n=29)和健康对照组(n=22)使用ExoQuick-TC进行富集分析,随后又使用外泌体microRNA(ExmiRNA)序列分析和第二代测序分析了每组的ExmiRNA谱,再通过Kruskal-Wallis试验,发现ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a在IPMN组和PDAC组中的表达均显著增加,使用qRT-PCR进一步评估这3个候选miRNA,结果显示PDAC和IPMN患者中ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a的表达明显高于对照组,为了评价3种血清外泌体miRNA的诊断性能,采用ROC曲线分析,在3种血清外泌体miRNA中,发现ExmiR-21的AUC最大,诊断准确率最高(IPMN诊断:准确率= 78.0%,PDAC诊断:准确率= 80.8%),而在对照和IPMN之间的ROC分析中,血清外泌体miRNA的AUC(ExmiR-191 AUC=0.741、ExmiR-21 AUC=0.7、ExmiR-451 AUC=0.742)和诊断准确率优于CA19-9和CEA,可看出 ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a是诊断IPMN和早期PDAC的良好标志物,此外,对照组与早期PDAC之间的ROC分析显示,血清外泌体miRNA的准确性优于CEA,这些结果都表明血清外泌体miRNA是诊断IPMN和PDAC的更敏感的标记物。

从研究趋势和进度来看,作为PDAC最常见囊性前体病变IPMN[32],更深入的研究和探索能够准确诊断出IPMN的血清miRNA,并进行相关靶向治疗改善其预后是有效避免PDAC发生的途径之一。但是现有的研究较少,有关的研究结论不足以让血清miRNA完全作为取代CA19-9或CEA的诊断标志物,仍需更加深入研究。

3.3 血清miRNA作为胰腺神经内分泌肿瘤诊断标志物 胰腺神经内分泌肿瘤(PNETs)是胰腺第二常见的上皮性恶性肿瘤,由于激素分泌过多和整体肿瘤质量偏低,导致发病率在过去几十年里显著增加,缺乏特异性的生物标志物抑制了早期诊断和临床有效药物的选择,PNETs通常在疾病已经进展或转移的晚期才被诊断出来[33]。现已存在不少有关PNETs的治疗方案,但也需要尽快找出高敏感性和特异性的诊断标志物。大多数已批准的PNETs治疗方案缺乏客观反应,这表明对PNETs的生物学理解仍然存在空白[33]。miRNA能够帮助各种胰腺病变的鉴别诊断,并将肿瘤样本与健康对照区分开,也可以改变PNETs生物标志物的管理,可能有助于治疗选择或反应评估。

Kövesdi等[34]使用第二代测序(NGS)来确定miRNA表达谱,然后使用单独的TaqMan检测进行验证,发现与对照组相比,在PNETs患者中观察到miRNAs的整体下调,其中的33种miRNAs的表达能够区分肿瘤样本与对照组。随后又通过PubMed将收集到的研究结果里差异表达miRNA与他们目前的研究结果进行交叉引用,发现PNETs中的9个miRNA在血清中存在失调,且仅有miR-203a-3p在PNETs组织和血清中均过表达,但是其在PNETs患者血清中的低丰度限制了其作为肿瘤标志物的广泛临床应用。他们还发现与单独使用嗜铬粒蛋白A(CgA)相比,联合使用let-7b-5p或miR-143-3p的个体表达在健康对照组中产生了更好的辨别能力。另外,Kim等[35]通过与人抗原D竞争并下调p27表达,抑制周期蛋白依赖性激酶活性和细胞增殖,证明了miR-30a在PNETs中促进癌细胞生长的作用。Michael等[36]强调了miRNA参与PNETs肿瘤发生的动态性质,利用基因工程小鼠模型,他们分析了一组先前发现在转移性PNETs中上调的miRNA,发现miR-137促进肿瘤生长和侵袭。Panarelli等[37]证实miRNA表达有助于神经内分泌肿瘤的鉴别诊断。

尽管miRNA参与PNETs的研究数量较少,数据也不一致,但它们与PNETs发生有关,是有希望的诊断、预后和治疗生物标志物[38]。最近有关研究结果提到的血清miRNA在PNETs中起到的作用也提示了其在早期诊断具有巨大潜力,值得我们深入挖掘与研究。本综述将上述3种胰腺癌亚型研究中提到的血清miRNA经ROC(受试者工作特征)分析得到的AUC(ROC曲线下的面积)值以及它们在患者中对比健康对照组的表达情况进行了整理和统计。见表1。

虽然笔者将以上血清miRNA的AUC值进行了整理和统计,但由于每个研究中所用的样本量和样本标准不一,且使用的计算方法可能也存在一定的区别,因此无法进行横向比较所提及的血清miRNA。但是,可以清晰的看到表格中miRNA作为胰腺癌诊断标志物的潜力,为以后的研究提供参考。

血清miRNA作为胰腺癌诊断的新型生物标志物具有检测灵敏、无创且易于获得的优势并且大大提高了早期诊断的准确率,在预后分析和癌症分型中有重要作用。但由于实验研究尚不充分,并且miRNA参与肿瘤细胞转移机制非常复杂需要进一步研究确定调控的确切机制,目前相关结论不足以说明血清miRNA可完全取代CA19-9或CEA作为新型生物诊断标志物。但是联合多种miRNA组合或与其他类型肿瘤诊断标志物可使诊断准确性显著提高。相信随着胰腺癌中特异性miRNA的不断发现,血清miRNA作为诊断标志物将提高胰腺癌各种亚型的确诊率,并为患者的早期治疗提供便利。因此血清miRNA作为新型分子标志物作用在胰腺癌的诊断、预后、侵袭和转移有极大的临床前景。