动脉Ⅲ号方对大鼠缺血下肢血管新生的影响

贾林龙，孙超楠，付佳娜，张晓丽，李晓亮，郑学军，陈阚鹰，徐家欣

下肢缺血性疾病是常见的外周血管疾病，包括糖尿病足、下肢动脉硬化闭塞症及血栓闭塞性脉管炎[1]。由于下肢动脉血管管腔狭窄、闭塞引起的供血不足，主要表现为下肢皮温降低、脉搏减弱、间歇性跛行、静息痛、肢体溃疡及坏疽等[2]。影响患者生活质量，严重者可致残、致死。本实验通过结扎并切断大鼠股动脉制造下肢缺血模型[3]，观察动脉Ⅲ号方对大鼠缺血下肢术口愈合情况、腓肠肌毛细血管数目以及外周血CD34 阳性细胞比例，以期探讨动脉Ⅲ号方对大鼠缺血下肢血管新生的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD 大鼠72 只，体质量为200～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK（京）2019-0008。饲养于山西省中医药研究院实验动物房，饲养温度25 ℃，湿度45%～50%。

1.1.2 药物 动脉Ⅲ号方（当归15 g，赤芍15 g，丹参15 g，石斛30 g，元参15 g，川牛膝15 g，连翘30 g，金银花30 g，益母草30 g，甘草10 g）饮片购买自山西中医药大学附属医院，通过传统水煎浓缩法，制成生药含量分别为2、1、0.5 g/mL 的药液，放入4℃的冷藏冰箱备用。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-GSF）注射液（山东齐鲁制药有限公司，国药准字S20123001，批号S19990049，150 μg：0.9 mL)用生理盐水稀释至浓度为37.5 g/mL。注射用青霉素钠（华北制药有限公司，国药准字H13020657，批号190508-02）。

1.1.3 试剂 HE 染色试剂，PE Anti-CD34 抗体[MEC 14.7](美国贝克曼库尔特有限公司，批号：ab23830)。

1.1.4 仪器 正置显微镜、石蜡切片机（上海徕卡显微系统有限公司），移液器（法国吉尔森P 型移液器公司），恒温烘箱（上海一恒科学仪器有限公司），摊片烤片机、自动组织脱水机（湖北康强医疗器械有限公司），生物组织包埋机-冷冻机、生物组织包埋机（泰维科技股份有限公司），流式细胞仪FC500(美国贝克曼库尔特有限公司)，电子体温计（广东健奥科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组 常规饲养1 周后，将72 只大鼠随机分为假手术组（12 只）和造模组（60 只）。造模组用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）行大鼠腹腔注射麻醉，选左侧腹股沟中点向膝部作一长度约2 cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，行股动脉结扎、切断及分支结扎术，术口撒青霉素8 U，手术完毕后缝合，建立大鼠下肢缺血模型。假手术组在麻醉下分离股动脉即可。术后连续2 d 对大鼠左下肢肌内注射青霉素8 U 以预防感染。通过大鼠的活动状态及左下肢与右下肢肢体温度对比判断模型是否成功，将成模大鼠再随机分为模型组、动脉Ⅲ号方高剂量组、中剂量组、低剂量组、rhGCSF 组，每组12 只。

1.2.2 给药及取材 按体表面积比值换算大鼠给药剂量，动脉Ⅲ号方高、中、低剂量组大鼠给予成人等效2、1、1/2 倍剂量（34.2、17.1、8.55 g/kg）的动脉Ⅲ号方药液灌胃，连续灌胃14 d，rhG-CSF 组大鼠给予60 kg 成人7 倍剂量（2.1 mL/kg）的稀释rhGCSF 注射液于左下肢皮下注射，模型组和假手术组大鼠给予蒸馏水灌胃，灌胃量为12 mL/kg，持续14 d。每组分别于7、14 d 用10%（3.5 mL/kg）水合氯醛腹腔麻醉6 只大鼠，通过下腔静脉取血1 mL，保存至EDTA 抗凝管后混匀。取左下肢腓肠肌与术口创缘组织，分别固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.2.3 左下肢远端温度 使用电子温度计分别于术后1、7、14 d 测量6 组大鼠双下肢的温度，计算温差。

1.2.4 CD34 阳性细胞比例测定 将1.2.2 中所取的下腔静脉血加入PE Anti-CD34 抗体[MEC 14.7]10 μL 进行染色，室温避光10 min。加500 μL 溶血剂PN: A1189，使用流式细胞仪检测，使用流式细胞仪FC500 软件进行数据分析。

1.2.5 术口创缘、左下肢腓肠肌病理学观察 将术口创缘组织、左下肢腓肠肌经脱水、包埋、切片（3 μm）、脱蜡后，按常规HE 染色方法操作，显微镜下观察，采用徕卡图象系统采集图片，通过Image-Pro Plus 图像分析软件统计腓肠肌毛细血管数目。

1.3 统计学方法 采用SPSS 27.0 统计学软件进行数据分析，实验数据为定量资料以±s 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组内不同时间比较采用配对t 检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠左下肢缺血模型建立及一般状态 术后造模组大鼠精神萎靡，不能自主活动，无饮食、饮水。术后1 d，大鼠左下肢活动障碍，术后假手术组大鼠基本正常，左下肢活动稍差。术后7 d，假手术组、动脉Ⅲ号方给药组和rhG-CSF 组大鼠术口愈合良好，肢体可活动。术后14 d，假手术组、动脉Ⅲ号方给药组和rhG-CSF 组大鼠术口体毛旺盛，左下肢可正常活动；模型组左下肢活动差。术后1 d，各造模组间温差均高于假手术组（P ＜0.05），大鼠下肢缺血模型建立成功。术后7 d，动脉Ⅲ号方高剂量组下肢温差高于rhG-CSF 组（P ＜0.05）；术后14 d，动脉Ⅲ号方高剂量组下肢温差与rhG-CSF 组差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间下肢温差比较（℃）

2.2 动脉Ⅲ号方对大鼠外周血CD34 阳性细胞比例的影响 模型组和动脉Ⅲ号方给药组术后14 d CD34 阳性细胞比例低于本组术后7 d （P ＜0.05），rhG-CSF 组与假手术组无统计学差异（P ＞0.05）；术后7 d，动脉Ⅲ号方高剂量组CD34 阳性细胞比例高于rhG-CSF 组（P ＜0.05）；术后14 d，动脉Ⅲ号方高剂量组CD34 阳性细胞比例较rhG-CSF 组无统计学差异（P ＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间外周血CD34 阳性细胞比例比较(%)

2.3 动脉Ⅲ号方对大鼠术口创缘组织愈合情况的影响 术后7 d，rhG-CSF 组创面组织炎性细胞浸润较少，创面平整，可见鲜红肉芽组织，创面愈合良好，模型组、假手术组和动脉Ⅲ号方给药组炎性细胞浸润明显，其中模型组炎性细胞浸润最为明显，肉芽鲜红，6组肉眼均未见炎症反应；术后14 d，动脉Ⅲ号方组、rhG-CSF 组和假手术组创面愈合，可见新生血管，胶原纤维排列紧密；模型组炎性细胞浸润。见图1。

图1 动脉Ⅲ号方对术后不同时间大鼠术口创缘组织病理形态的影响（HE，×200）

图3 动脉Ⅲ号方对术后不同时间大鼠左下肢腓肠肌病理形态的影响（HE，×200）

2.4 动脉Ⅲ号方对大鼠左下肢腓肠肌血管数目的影响 模型组可见肌纤维萎缩，肌间隙增宽。动脉Ⅲ号方给药组和rhG-CSF 组腓肠肌肌纤维排列整齐紧密。模型组和动脉Ⅲ号方给药组术后14 d 腓肠肌毛细血管计数高于本组术后7 d（P ＜0.05），rhGCSF 组和假手术组无统计学差异（P ＞0.05）；术后7 d，动脉Ⅲ号方高剂量组腓肠肌毛细血管计数低于rhG-CSF 组（P ＜0.05）；术后14 d 动脉Ⅲ号方高剂量组腓肠肌毛细血管计数与rhG-CSF 组无统计学差异（P ＞0.05）。见表3、图2。

表3 各组大鼠不同时间腓肠肌毛细血管计数比较（个）

3 讨论

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类可以循环、增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞[4]。EPCs 增殖、分化为血管内皮细胞是血管新生的重要环节，维持体内血液循环系统的稳定及更新。当血管损伤或组织缺血时会产生刺激，动员骨髓中的EPCs 转移至外周血中，成熟分化为血管内皮细胞，在缺血组织中生成血管，最终建立侧支循环。CD34 是高度糖基化的I 型跨膜糖蛋白[5]，在EPCs 上表达，是EPC 的表面标志物之一，随着EPCs 的成熟，CD34 蛋白的表面表达逐渐减弱。CD34 的表达标志着EPCs 的增殖、分化为血管内皮细胞的过程，是血管新生检测的一个重要指标。

血是构成人体和维持人体生命活动的最基础物质[6]。《素问·调经论》记载:“人之所有者，血与气耳。”强调了血对人体的重要程度。在下肢缺血性疾病中，由于脉络瘀阻，血不能达肢端而发生坏疽，《景岳全书·血证》中记载“血衰则形萎，血败则形坏”，所以，古今各医家在治疗下肢缺血性疾病时，以活血化瘀为基本大法[7-8]。郑学军主任根据多年的治疗经验，认为下肢缺血患者多为年长者且慢性发病，瘀血滞于脉内，“瘀血不去，新血不生”，津血同源，津血亏虚日久导致阴虚，提出了育阴清热、活血化瘀的治疗思路，郑学军主任在四妙勇安汤的基础上加味为动脉Ⅲ号方，方中当归养血活血，赤芍凉血散瘀止痛，丹参助当归活血祛瘀，石斛、玄参滋阴，川牛膝活血、引药下行，提高疗效，金银花、连翘清热解毒，益母草活血化瘀，甘草清热解毒，调和诸药。根据现代药理学研究，玄参提取物可抗炎和降血脂，从而延缓动脉的硬化，具有抗血小板凝集、扩张血管的作用[9]。石斛可以抗血小板聚集、抗氧化、延缓动脉硬化的进程[10-11]；玄参化学成分中的京尼平苷和石斛生物碱类都能降血糖、血脂，改善血液高凝状态[12-13]；益母草碱可以抗氧化、抗动脉硬化，还可扩张股动脉，增加血流量；可通过降低血浆黏度从而抗血栓形成[14]。全方共奏养阴生津，活血化瘀，清热解毒之效，通过生新血、化瘀血、通血脉改善缺血症状。

侧支循环的建立是血管损伤和组织缺血的代偿反应[15]，血红细胞是血液中数量最多的细胞，成熟的红细胞没有细胞核，缺血组织血管新生建立侧支循环，可见血红细胞增多，密集分布于肌纤维间隙。血红细胞数目和分布代表血管的数目，多个血红细胞成簇分布或成连续线形排列仅表示为一个血管。创面组织的愈合分为炎症阶段、修复阶段及成熟阶段[16]，炎症阶段需要血小板止血，中性粒细胞吞噬细菌起到清创作用；修复阶段需要红细胞运输营养的氧气，为伤口的高代谢提供基础；成熟阶段血管内皮细胞凋亡，血管密度正常；所以创面愈合受循环系统的影响。本实验证明动脉Ⅲ号方可以将大鼠骨髓中的EPCs 转移至外周血，在缺血组织中参与血管新生，建立侧支循环，恢复血供，改善组织缺血并促进创面愈合[17]。动脉Ⅲ号方高剂量组外周血中EPCs 数量和腓肠肌红细胞数最多，与rhG-CSF 组不相上下，但rhG-CSF 组可以更快地动员EPCs，加快血管的新生；中剂量组次于高剂量组，低剂量次于中剂量组，说明外周血中EPCs 数量与给药的剂量相关，还需通过进一步试验确定不同剂量对外周血中EPCs 的影响，从而计算最佳的用药剂量，通过实验确定最佳疗效的药物剂量，指导临床用药。动脉Ⅲ号方和rhG-CSF 能提高腓肠肌肌纤维微血管数，rhG-CSF 能更快形成新生血管，但达到一定程度后血管数与动脉Ⅲ号方数量相当。

综上所述，动脉Ⅲ号方能增加外周血CD34 阳性细胞比例，促进血管新生。动脉Ⅲ号方对下肢缺血的作用机制可能是将骨髓中的EPCs 转移到外周血，到达缺血组织，参与血管新生，形成侧支循环，改善组织缺血，促进伤口愈合。但动脉Ⅲ号方是否干预血管内皮细胞相互黏附排成直线以及形成开放的腔样结构的过程仍待研究。