外源葡萄糖通过调控蔗糖代谢增强采后杏果实的抗冷性

张 昱，芦玉佳，赵亚婷，梁可欣，任新雅，刘志旭，石慧敏，朱 璇

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

新疆‘赛买提’杏（Prunus armeniacaL. cv.Saimaiti）风味独特、果香浓郁、营养价值丰富，深受当地消费者喜爱，具有较高的商业价值[1]。杏属于呼吸跃变型水果，且采收多集中于高温季节，这导致果实后熟迅速，货架时间短[2]。目前大量研究已经证实了低温贮藏是延缓果实采后衰老、品质劣变和腐烂的常用策略之一[3]。但杏是冷敏性水果，在低温贮藏期间易发生冷害，致使果实生理代谢紊乱，这是影响果实长期贮藏的主要限制因素[4-5]。因此如何减少果实在冷藏期间冷害的发生是目前鲜杏贮运产业亟需解决的问题。

可溶性糖含量与果实的品质和口感密切相关，同时较高含量的可溶性糖在果实抵御低温胁迫中起着重要的作用[6-8]。研究发现，葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性糖可通过作为渗透压调节剂、低温保护剂、活性氧清除剂及信号分子等多重作用来缓解果实的低温胁迫[9-11]。Shao Xingfeng等[12]研究发现，热处理可通过增强枇杷果实贮藏期间葡萄糖和果糖的含量来增强枇杷果实的耐冷性。Wang Zheng[3]与张杼润[13]等研究发现，较高的葡萄糖与果糖水平可缓解杏果实的冷害现象。然而，这3 种可溶性糖在果实抵御低温胁迫中所起的作用因果实种类和品种等差异而有所不同。Wang Ke[7]与董欣瑞[14]等研究发现，较高的蔗糖水平可缓解桃果实的冷害现象。在柑橘中也发现类似的结果，热处理导致的蔗糖含量增加可能有助于提高柑橘果实的耐冷性[6]。

葡萄糖不仅是植物体内主要的能量供应物质，同时也可作为结构物质为合成酚类及黄酮类等物质提供碳骨架[15-16]。此外，研究表明，外源葡萄糖的施用可使园艺作物提质增产、缓解植物逆境胁迫、调控植物成熟衰老[15-17]。Wei Jia等[17]研究发现，外源葡萄糖处理可提高甘蓝和小白菜芽中的总酚与花青素的含量；Huang Yawen等[16]研究发现，葡萄糖预处理在一定程度上降低了热胁迫黄瓜的活性氧积累和膜脂质过氧化，增强了黄瓜幼苗的耐热性。Wang Yuanhua等[18]研究发现，外源葡萄糖处理可有效保持采后草莓的贮藏品质，并提高其抗氧化能力。然而，目前关于外源葡萄糖处理对采后杏果实蔗糖代谢与冷害的影响还鲜有报道。因此本实验以新疆‘赛买提’杏为材料，研究不同浓度葡萄糖处理对杏果实采后冷害与糖代谢的影响，旨在为杏果实冷害的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘赛买提’杏果实于2021年6月27日采自新疆英吉沙县乌恰镇试验田，选取成熟度、大小相近、无病虫害和机械损伤的杏果实，并立即运回新疆农业大学果蔬采后贮藏实验室。

果糖、葡萄糖、蔗糖标准品（纯度≥99%） 上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖、氯化镁、氢氧化钠、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、乙酸锌、亚铁氰化钾、蒽酮、甘油（均为分析纯） 天津致远化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

GY-4果实硬度计 浙江艾德堡仪器有限公司；NR10QC色差仪 广东三恩时智能科技有限公司；PAL-1便携式数显折光仪 日本Atago公司；UF-103型紫外分光光度计 上海优尼克仪器有限公司；3HBRI型高速冷冻离心机 湖南海澜仪器设备有限公司；LC-20AB高效液相色谱仪 日本岛津公司；HH-2S恒温水浴锅常州中纤检测仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏果实处理

参照本课题组前期研究结果[19]，采用减压渗透法处理杏果实，处理组分别用100、200、400 mmol/L葡萄糖溶液对杏果实进行减压渗透处理；以蒸馏水减压渗透处理作为对照组。各组处理均重复3 次，每次重复4 kg果实。待果实晾干后于温度（0±1）℃、相对湿度90%～95%的冷库中贮藏。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 冷害发病率及冷害指数的测定

参照何欢等[5]的方法进行冷害发病率及冷害指数测定。

1.3.2.2 硬度、色泽、可溶性固形物质量分数的测定

杏果实硬度采用GY-4硬度计测定；色泽采用NR10QC色差仪测定；可溶性固形物质量分数（soluble solids content，SSC）采用PAL-1糖度仪测定。

1.3.2.3 可滴定酸质量分数和抗坏血酸含量的测定

参照曹建康[20]的方法测定可滴定酸（titratable acidity，TA）质量分数和抗坏血酸（ascorbic acid，ASA）含量。TA质量分数采用氢氧化钠滴定法测定；ASA含量采用2,6-二氯靛酚滴定法测定，单位为mg/100 g。

1.3.2.4 丙二醛含量和细胞膜渗透率的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量参照曹建康等[20]的方法测定，单位为nmol/g。细胞膜渗透率参照曹建康等[17]的方法，采用电导率法测定，单位为%。

1.3.2.5 蔗糖、果糖和葡萄糖含量的测定

采用液相色谱法测定可溶性糖含量[21]。提取方法：称取5.0 g经过匀浆处理的杏果肉样品，加超纯水50 mL，加入10.6 g/100 mL亚铁氰化钾溶液和21.9 g/100 mL乙酸锌溶液各5 mL，磁力搅拌30 min，加超纯水定容至100 mL。经0.22 μm水系滤膜过滤，进样高效液相色谱仪进行分析。每处理选果3 个，重复3 次。

1.3.2.6 蔗糖代谢相关酶活力的测定

参照Jiang Hanyu等[22]的方法测定蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthase、SS）活力。粗酶液提取：取2.0 g杏果实样品，液氮研磨后加入200 mmol/L pH 7.5 Hepes-NaOH溶液5 mL。将混合物在10 000 r/min下离心10 min，上清液即为粗酶液。SPS的测定体系包括：0.1 mL粗酶液、0.5 mL 50 mmol/L Hepes-NaOH缓冲液（pH 7.5）、0.2 mL 15 mmol/L MgCl2、0.15 mL 5 mmol/L 果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F-6-P）、0.15 mL 15 mmol/L葡萄糖-6-磷酸（glucose 6-phosphate，G-6-P）、0.2 mL 10 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG），反应体系在37 ℃下孵育60 min，然后加入100 μL、质量分数30% KOH溶液终止反应，用蒽酮测定法测定该反应产生的蔗糖量，以每克鲜质量样品每小时产生的蔗糖的物质的量表示SPS活力，单位为μmol/（h·g）。SS活力测定时的混合物体系为0.1 mL粗酶液、0.5 mL 50 mmol/L Hepes-NaOH缓冲液（pH 7.5）、0.2 mL 15 mmol/L MgCl2、0.15 mL 10 mmol/L果糖、0.2 mL 10 mmol/L UDPG，其余操作及定义同SPS活力，单位为μmol/（h·g）。

酸性转化酶（acid invertase，AI）和中性转化酶（neutral invertase，NI）活力的检测参考Cao Shifeng等[23]的方法。将约0.2 mL粗酶液与0.8 mL反应缓冲液（0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）、0.1 g/L蔗糖）混合，34 ℃孵育1 h，采用3,5二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法检测反应过程中产生的葡萄糖量，以每克鲜样每小时产生的葡萄糖物质的量表示AI活力，单位为μmol/（h·g）。将约0.2 mL粗酶液与0.8 mL反应缓冲液（含1 g/L蔗糖、pH 7.5 0.1 mol/L磷酸缓冲液、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸）混合，其余操作及定义同AI活力，以每克鲜样每小时产生的葡萄糖物质的量表示NI活力，单位为μmol/（h·g）。

1.4 数据处理与分析

所有物质含量、酶活力结果均以鲜质量计，采用Excel 2010软件进行数据结果计算。用SPSS 22.0软件对实验数据进行方差分析，采用Duncan检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。使用GraphPad Prism 8.0.2和Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 外源葡萄糖处理对杏果实采后冷害发病率及冷害指数的影响

如图1A所示，在贮藏期间，杏果实的冷害发病率不断上升。在贮藏14 d时，对照组的杏果实已发生冷害，而葡萄糖处理组在21 d时才开始发生冷害。此时（21 d）对照组杏果实冷害发病率分别是100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组的1.23、2.09、1.23 倍。在贮藏第49天时，100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组杏果实冷害发病率分别比对照组低15.87%、34.92%和19.04%（P＜0.05）。结果表明，不同浓度的葡萄糖处理均可显著抑制杏果实冷害发病率的上升。

如图1B所示，在贮藏过程中，杏果实的冷害指数呈上升趋势，200 mmol/L葡萄糖处理组冷害指数在贮藏过程中显著低于对照组。在贮藏结束时，对照组冷害指数分别是100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组的1.31、1.81、1.36 倍（P＜0.05）。说明外源葡萄糖处理可显著抑制杏果实冷害指数的上升。

与对照组相比，外源葡萄糖处理对杏果实采后冷害发病率和冷害指数都有一定的抑制作用，其中以200 mmol/L葡萄糖处理效果最显著。

2.2 外源葡萄糖处理对杏果实采后贮藏品质的影响

2.2.1 外源葡萄糖处理对杏果实色泽的影响

色泽是反映杏果实成熟度最直观的指标之一。L*值表示果实的亮度，如图2A所示，在贮藏期内，各组杏果实的L*值均不断下降。在贮藏期14～49 d时，200 mmol/L葡萄糖处理组杏果实的L*值显著高于对照组（P＜0.05）。a*值表示果实的红绿程度，a*值越大则果皮越红，反之越绿。如图2B所示，在贮藏过程中，杏果实的a*值呈现逐渐上升的趋势，对照组a*值上升速率快于葡萄糖处理组。在贮藏结束时，200 mmol/L葡萄糖处理组的杏果实a*值分别比对照组、100 mmol/L葡萄糖处理组和400 mmol/L葡萄糖处理组低23.07%、11.53%、21.32%（P＜0.05）。如图2C所示，在整个贮藏过程中，杏果实的b*值呈先上升后保持稳定的趋势，且各葡萄糖处理组b*值低于对照组，在第49天时，200 mmol/L葡萄糖处理组b*值比对照组低5.70%（P＜0.05）。说明，外源葡萄糖处理可有效维持杏果实贮藏期间的色泽，其中200 mmol/L葡萄糖处理效果最显著。

图2 外源葡萄糖对杏果实采后L*值（A）、a*值（B）、b*值（C）的影响Fig. 2 Effect of exogenous glucose on L* (A), a* (B) and b* (C) values of postharvest apricot fruit

2.2.2 外源葡萄糖处理对杏果实硬度、TA质量分数、ASA含量、SSC的影响

如图3A所示，在贮藏期间，杏果实硬度不断降低，外源葡萄糖处理组杏果实的硬度高于对照组。在贮藏第49天时，200 mmol/L葡萄糖处理组的硬度比对照组高23.74%（P＜0.05）。说明适宜浓度的外源葡萄糖处理可有效维持杏果实硬度。

图3 外源葡萄糖对杏果实采后硬度（A）、TA质量分数（B）、ASA含量（C）和SSC（D）的影响Fig. 3 Effect of exogenous glucose on the hardness (A), and TA (B),ASA (C) contents and SSC (D) of postharvest apricot fruit

如图3B、C所示，贮藏期间，杏果实TA质量分数与ASA含量呈下降趋势。在贮藏初期，对照组TA质量分数下降迅速，在第14天时100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组TA质量分数分别是对照组的1.11、1.12、1.08 倍（P＜0.05）；在贮藏第35天时，100、200 mmol/L葡萄糖处理组杏果实AsA含量分别比对照组高14.75%、25.98%（P＜0.05）。说明适宜浓度的外源葡萄糖处理可有效维持贮藏期间杏果实TA质量分数与ASA含量。

如图3D所示，在贮藏前期SSC不断上升，对照组杏果实SSC在14 d时达到峰值，而各葡萄糖处理组杏果实SSC在21 d时达到顶峰，此时（21 d），100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组杏果实SSC比对照组分别高10.61%、8.84%、7.07%（P＜0.05）。在42 d时，100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖处理组杏果实SSC分别是对照组的1.06、1.13、1.07 倍（P＜0.05）。说明适宜浓度的外源葡萄糖处理可有效保持杏果实的SSC。

综上所述，外源葡萄糖处理可维持杏果实的贮藏品质，但以200 mmol/L葡萄糖处理效果最佳，故将200 mmol/L葡萄糖处理作为最佳浓度用于后续的实验分析。

2.3 外源葡萄糖处理对杏果实采后细胞膜渗透率及MDA含量的影响

如图4A、B所示，在贮藏过程中，杏果实的MDA含量与细胞膜渗透率呈上升趋势。但200 mmol/L葡萄糖处理组杏果实MDA含量与细胞膜电解质渗透率上升速率低于同期对照组。在贮藏第49天时，对照组MDA含量比200 mmol/L葡萄糖处理组高0.27 倍（P＜0.05），细胞膜渗透率比200 mmol/L葡萄糖处理组高0.18 倍（P＜0.05）。结果表明外源葡萄糖处理可显著抑制杏果实贮藏期MDA的积累与细胞膜电解质渗透率的上升。

2.4 外源葡萄糖处理对杏果实采后可溶性糖含量的影响

如图5A所示，在贮藏第0～14天，对照组蔗糖含量迅速下降，而葡萄糖处理组则呈上升趋势。在贮藏的21～35 d，各组蔗糖含量均呈下降趋势。在贮藏第28～42天，对照组蔗糖含量显著高于葡萄糖处理组，在第28天时，对照组蔗糖含量比葡萄糖处理组高0.12 倍（P＜0.05）。如图5B所示，葡萄糖处理组在贮藏期间（14～49 d）果糖含量逐渐上升，从第21天起两组间开始出现显著性差异。在贮藏第49天时，葡萄糖处理组果糖含量比对照组高6.55%（P＜0.05）。如图5C所示，贮藏初始时外源葡萄糖处理组葡萄糖含量呈快速，在贮藏第7天时，外源葡萄糖处理组葡萄糖含量比对照组高8.70%（P＜0.05），且整个贮藏过程中外源葡萄糖处理组的葡萄糖含量均显著高于对照组。

图5 外源葡萄糖处理对杏果实蔗糖（A）、果糖（B）和葡萄糖（C）含量的影响Fig. 5 Effect of exogenous glucose treatment on the contents of sucrose (A),fructose (B) and glucose (C) in apricot fruit

2.5 外源葡萄糖处理对杏果实采后蔗糖代谢相关酶活力的影响

如图6A、B所示，在整个贮藏期间杏果实AI与NI活力先上升后下降，并在21 d时达到峰值，此时对照组AI活力比外源葡萄糖处理组低26.94%（P＜0.05）；外源葡萄糖处理组的NI活力比对照组高21.49%（P＜0.05）。在贮藏后期，对照组AI与NI活力下降迅速，在49 d时，外源葡萄糖处理组杏果实AI活力是对照组的1.83 倍（P＜0.05）；对照组NI活力在42 d时比外源葡萄糖处理组低22.22%（P＜0.05）。

图6 外源葡萄糖处理对杏果实 AI（A）、NI（B）、SS（C）和SPS（D）活力的影响Fig. 6 Effect of exogenous glucose treatment on AI (A), NI (B), SS (C)and SPS (D) activities of apricot fruit

如图6C所示，杏果实SS活力呈先上升后下降趋势，在14 d时，外源葡萄糖处理组SS活力是对照组的1.36 倍（P＜0.05），在第42天时，外源葡萄糖处理组杏果实SS活力比对照组高23.91%（P＜0.05）。

如图6D所示，贮藏期间，对照组杏果实SPS活力呈逐渐下降趋势，而外源葡萄糖处理组在贮藏前期（0～14 d）SPS活力略有增加，之后呈下降趋势。在14 d时，外源葡萄糖处理组SPS活力是对照组的1.21 倍（P＜0.05）。在第49天时，外源葡萄糖处理组杏果实SPS活力比对照组高1.71 倍（P＜0.05）。

3 讨 论

葡萄糖是植物细胞中主要的代谢前体及生物质来源，同时还可作为信号分子参与调控植物生长发育进程[16,24]。有研究表明，外源葡萄糖处理可有效提高青花菜货架期间的抗氧化相关酶的活性，从而降低其衰老与黄化的速度[25-26]。Wu Jiang等[27]研究发现，葡萄糖可作为渗透调节剂，通过保持细胞质膜完整性来保护西瓜幼苗免受低温胁迫。本实验研究发现，200 mmol/L葡萄糖处理可通过调控蔗糖代谢相关酶活性，提高贮藏期间葡萄糖与果糖的含量，抑制MDA的积累与细胞膜电解质渗透率的上升，从而有效降低果实冷害发病率与冷害指数的升高，保持杏果实的贮藏品质。

细胞膜损伤是植物遭受低温胁迫的原初反应结果[12]，在低温环境下，细胞膜由液晶状转变为凝胶状，结构受损，致使胞内电解质外渗[5,12]。此外，在低温胁迫下活性氧过度积累引起的膜过氧化损伤也是加剧冷害的重要原因之一[5,28-29]。由此说明，果实抗冷性的强弱与细胞膜完整性密切相关。同时研究发现，蔗糖代谢在果实抵御低温胁迫中发挥了重要作用[7,12,30]。SPS、SS、AI、NI是果实蔗糖代谢的关键酶，SS在蔗糖的转化过程中具有双重作用，可同时参与蔗糖的合成与分解；AI与NI可催化蔗糖分解为葡萄糖与果糖；而SPS则可催化果糖、葡萄糖转化为蔗糖[7,23]。Zhu Yi等[31]研究发现，低温胁迫下较高的AI、NI和SS活性所导致的蔗糖和还原糖的积累与木瓜果实较高的抗冷性有关。在本实验中，葡萄糖处理组在贮藏前期（0～14 d）SS与SPS活力出现上升趋势，随后缓慢下降；而对照组SPS活力在整个贮藏期间呈现下降趋势。其原因可能是外源葡萄糖的介入打破了可溶性糖转化的平衡，促进了贮藏前期蔗糖的合成。而在贮藏中后期，葡萄糖处理组的NI、AI活力在第21天时达到高峰，且始终高于对照组，这可能会促使蔗糖分解，从而导致葡萄糖处理组果实的蔗糖含量低于对照组果实，进而促使葡萄糖处理组果实保持较高水平的葡萄糖与果糖含量。这与Wang Zheng等[3]的研究结果相似，即杏果实耐寒性的增强与其较高的葡萄糖与果糖含量有关。同时，在本研究中，外源葡萄糖处理显著抑制了果实贮藏期间MDA的积累与细胞膜电解质渗透率的上升。其原因可能是外源葡萄糖处理有效提高了贮藏期间杏果实的葡萄糖与果糖的含量，增强了果实的抗氧化能力，这有利于增强细胞膜的稳定性，从而显著降低果实的冷害发病率与冷害指数。研究表明，热处理可通过提高枇杷果实葡萄糖含量来诱导增加果实抗坏血酸-谷胱甘肽循环活性，从而降低膜过氧化损伤程度，提高果实抗冷性[12]，这与本实验研究结果相似。此外，研究表明，葡萄糖等还原糖也可作为渗透压调节剂，通过稳定杏果实冷藏期间的细胞渗透压减轻膜损伤程度，从而减少冷害的发生[3,31]。

冷害所造成的细胞不可逆损伤是导致果实品质劣变、缩短贮藏期的主要原因之一[7,23,32]。当果实遭受冷害时，果皮出现褐变现象，色泽变暗，同时果实内部组织絮败软化。本实验研究发现，与对照组相比，适宜浓度的外源葡萄糖处理可有效保持杏果实的色泽与硬度，同时有效抑制贮藏期间SSC、TA质量分数与ASA含量的下降，较好地保持果实的贮藏品质。在草莓果实的研究中也发现类似的结果，即外源葡萄糖处理维持了采后草莓的贮藏品质，延长其贮藏期[18]。这说明外源葡萄糖在降低果实冷害、保持果实贮藏品质方面具有一定的应用潜力与价值。

4 结 论

外源葡萄糖处理可有效调控杏果实贮藏期间蔗糖代谢相关酶SS、SPS、AI、NI的活力，提高果实体内葡萄糖与果糖含量，同时降低贮藏中后期蔗糖的含量，抑制MDA的积累与细胞膜渗透率的上升；同时，适宜浓度（200 mmol/L）的外源葡萄糖处理可保持杏果实的硬度、色泽、SSC、TA质量分数与ASA含量，显著降低杏果实的冷害发病率与冷害指数，说明外源葡萄糖处理可通过调控杏果实蔗糖代谢增强果实的抗冷性。