蜂蜡含量对纳米结构脂质载体消化释放行为及巨噬细胞摄取率的调控影响

田文妮，宋增柳，杨 渌，肖 杰,2,*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东省功能食品活性物重点实验室，广东 广州 510642）

纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLCs）是由脂质基质（室温下固体脂和液体油组成的混合脂质相）在表面活性剂作用下形成的乳液胶体分散体系[1]。相比于固体脂质纳米颗粒（油相由室温下为固态的固体脂组成）或纳米乳液（油相由液体油组成），NLC脂质相中固体脂与液体油同时存在，具有不完美的晶体结构，这种无序缺陷型晶格结构为无定形状态或非晶簇形态的功能组分提供更多负载空间，不仅可提高负载量和包封效率，而且能够减少储存过程中功能组分的析出渗漏，体现出更高的胶体稳定性[2-3]。此外，NLC具有可控的流变行为、消化缓释特性、生物膜亲和性、组织黏液渗透性和上皮细胞吸收率。这些独特的优势对提高活性物质的生物利用度和健康功效具有重要作用[4-5]。

姜黄素具有抗炎、抗肿瘤等生物功效，可通过调控巨噬细胞中抗炎因子的分泌而发挥抗炎活性[6]。然而，姜黄素溶解度和生物可及性低，在炎症部位（巨噬细胞）吸收效率低，极易排出体外[7-10]。这些因素限制了姜黄素抗炎活性的发挥。通过构建NLC负载递送体系，提高姜黄素在胃肠道中的分散性，增强其在炎症部位的时滞性和黏液渗透性，是一种可行的策略[11-12]。研究表明，脂质相组成（如固体脂种类和固体脂比例）是影响NLC制备和物理特性的重要因素[13]。不同熔点的固体脂质（如蜂蜡、棕榈蜡、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸）可通过影响NLC中结晶的形成和分布行为进而调控其包封效率和稳定性[14-15]。蜂蜡是一种由正烷烃、酯类、脂肪酸和脂肪醇（碳链长为18）组成的固体脂质（熔点65 ℃），可在室温下自组装形成晶体；将蜂蜡与液体油（如中链脂肪酸、大豆油）加热混合后冷却，可获得结构化的脂质相[15]。作为天然的可食性固体脂，蜂蜡在构建脂质基乳液（如NLC、固体脂质载体）、凝胶（如乳液凝胶、油凝胶）等递送载体的应用中具有广阔的前景[16]。此外，固体脂占脂质相的比例也是影响NLC结构性能和理化特性的关键因素，Solemanian等[16]从晶体结构角度揭示了蜂蜡（固体脂质）与石榴籽油的质量比对NLC粒径、Zeta电位和稳定性的影响。Alotaibi等[17]发现通过调控油酸（液体脂质）和月桂酸（固体脂质）的质量比可显著调控NLC的结构特性、包封率、负载率、释放行为和生物利用度。综上，以固体脂占脂质相的比例为调控切入点开展其对NLC结构特性、消化释放行为及巨噬细胞摄取的调控研究对提高亲脂活性成分姜黄素抗炎活性具有重要指导意义。

本研究采用高速乳化-探头超声法制备不同蜂蜡含量的负载姜黄素的NLCs。基于对不同蜂蜡含量NLCs的结构性质、封装效率和剪切流变行为的研究，揭示脂质相中蜂蜡含量对NLCs微观形貌、粒径电位、负载率、包封率、储存稳定性和表观黏度的调控规律。基于体外黏液黏附和模拟消化实验，阐释脂质相中蜂蜡含量通过调控NLCs结构和流变特性对负载姜黄素的NLCs在小肠的黏液黏附渗透行为、脂质消化和姜黄素释放行为的调控作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

RAW264.7细胞 中国科学院细胞库；SPF级7 周龄SD大鼠 湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物使用许可证号：SYXK（粤）2022-0136。

吐温80（Tween 80）、蜂蜡（由碳链长为30的正烷烃、碳链长为35的长链脂肪酸酯、碳链长为18的脂肪酸和脂肪醇组成）、中链脂肪酸甘油三酯（medium-chain triglycerides，MCT）、姜黄素（纯度＞98.0%） 上海源叶生物科技有限公司；4%福尔马林、无水乙醇（均为试剂纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；青霉素、链霉素、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、高糖DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）细胞培养基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染剂 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

JY92-IIDN超声波破碎仪 宁波信智生物科技有限公司；PT 2500 E高速剪切机 瑞士Kinematica公司；KDC-120HR高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；FEI/Talos L120C透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM） 美国FEI公司；Axio Observer A1荧光倒置显微镜 德国Carl Zeiss公司；Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度仪 英国Malvern公司；Synergy LX多功能酶标仪酶标仪 美国BioTek公司；KAAKE MARS流变仪 美国赛默飞世尔科技公司；动物活体可见光成像系统IVIS Lumina CT III成像设备 美国珀金埃尔默仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NLC的制备

以MCT及蜂蜡为混合油相，固定脂质相在乳液体系中质量分数为30%，吐温80质量浓度为3 g/100 mL，调控蜂蜡在脂质相中的质量分数分别为0%、5%、10%，采用高速乳化-探头超声法制备NLC[12]，分别将样品命名为NLC0、NLC5和NLC10。具体操作步骤如下：MCT和蜂蜡在75 ℃下混合并熔化，形成均一的混合油相，将模式活性物（姜黄素）按质量比1∶60添加到混合油相中，磁力搅拌（转速600 r/min，时间5 min）混合均匀。按比例逐滴加入质量浓度为3 g/100 mL的吐温80双重蒸馏水溶液（75 ℃）。将水相均匀分散于脂相中并使用均质器以10 000 r/min进行4 min均质化以制备乳液。接着，采用超声波探头对制备好的乳液进行进一步处理，超声功率65 W，总超声时间为12 min，超声程序采用工作时间4 s，间歇时间4 s，超声完成后迅速置于冰浴中，保持24 h以获得NLC。

1.3.2 TEM观察

NLC样品用双重蒸馏水稀释100 倍，放在200 目铜网格上，然后在室温下风干，采用TEM观察NLC的形貌特征[17]。

1.3.3 粒径分布和Zeta电位测定

采用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）分析NLC的粒径分布和Zeta电位[18]。用双重蒸馏水将NLC样品稀释10 倍，使用Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度仪，在90°的固定散射角下进行DLS分析。材料和分散剂的折射率分别为1.450和1.330，温度设置为25 ℃。将样品置于室温下（25 ℃），监测NLC样品在4 周内的粒径和Zeta电位，以此来评价其稳定性。

1.3.4 负载率和包封率测定

精密配制不同质量浓度（3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 g/mL）的姜黄素乙醇标准品溶液，以吸光度为纵坐标，姜黄素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。将NLC以15 000 r/min离心30 min后取脂质相上清液用无水乙醇按体积比1∶1进行萃取。使用酶标仪测定其在425 nm波长处的吸光度，根据标准曲线方程计算上清液中姜黄素的质量浓度。姜黄素在NLC的负载率和包封率分别按公式（1）、（2）计算[12]。

式中：m姜黄素为负载姜黄素的NLC中姜黄素的质量/g；mi为负载姜黄素的NLC干燥后的总质量/g。

式中：m0是初始姜黄素的总质量/g；m游离姜黄素是游离在外水相（上清液）中姜黄素的质量/g。

1.3.5 黏度测定

采用流变仪测定样品的剪切黏度特性[19]。在两个平行板的几何测量单元之间放置大约1 g的NLC样品，并将间隙的高度设置为1 mm。样品在25 ℃下保持2 min，在剪切速率为0～100 s－1的范围内测定样品表观黏度。

1.3.6 离体肠黏附渗透实验

采用离体肠模型进行体外黏附渗透研究[20]。解剖SD大鼠获取新鲜的小肠，剪成等面积的离体肠切片，将样品（姜黄素悬液、负载姜黄素的NLC0、NLC5和NLC10，各组的姜黄素总量为0.8 mg）滴注于离体肠切片上，于37 ℃水浴箱中孵育30 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗离体肠，用4%福尔马林固定，DAPI染色后使用IVIS成像设备成像，测定荧光强度。

1.3.7 体外消化实验

负载姜黄素的NLC在模拟胃液和模拟肠液中的消化情况参照之前的研究[12]开展。NLC在模拟胃液（0.11 mmol/L脱氧胆酸钠、34.2 mmol/L氯化钠、2 mg/mL胃蛋白酶和5 mg/mL吐温80，pH 2.0）中孵育1 h，然后在模拟肠液（3.90 mmol/L牛磺胆酸钠、19.12 mmol/L马来酸、10 mg/mL胰蛋白酶和5 mg/mL吐温80，pH 7.2）中孵育2 h。采集样品：NLC在上述模拟体外消化过程的预定时间点（胃模拟消化过程0、30、60 min；小肠模拟消化过程0、5、15、30、45、60、90、120 min）取2 mL消化液，并用等量相应的模拟液替换。将各时间点取出的消化液在11 180×g下离心30 min（4 ℃），通过膜过滤（0.22 μm滤膜过滤器）取上清液，并记录该体积，按V（消化液）∶V（无水乙醇）＝1∶4混合，利用分光光度计测定425 nm波长处样品吸光度，以不同质量浓度姜黄素标准品绘制标准曲线，并根据标准曲线方程求出样品中姜黄素的质量浓度，从而计算得到在模拟消化过程中姜黄素的释放量。

在模拟肠液中进行脂肪分解时，通过手动添加0.25 mol/L NaOH，使pH值保持在7.20±0.02。采用Excel软件记录随时间消耗的NaOH体积，计算脂肪分解产生游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的浓度。FFA的释放量按公式（3）计算。

式中：VNaOH是中和产生FFA所需的氢氧化钠体积/L；cNaOH是所使用的氢氧化钠溶液的浓度/（mol/L）；mlipid是最初体系中三酰甘油的质量/g；Mlipid是三酰甘油的摩尔质量/（g/mol）。

采用Gompertz s模型评估模拟肠道消化前40 min内FFA释放的动力学。FFA的释放动力学参数按公式（4）计算。

式中：K代表FFA在拐点的释放速率/min－1；C代表FFA的最大释放量/%；μ代表FFA释放曲线中的滞后时间/min；t代表FFA释放曲线中横坐标的每个时间点/min。

1.3.8 RAW264.7小鼠巨噬细胞摄取实验

RAW264.7小鼠巨噬细胞用高糖DMEM细胞培养基（体积分数10%的磷酸盐缓冲溶液，100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素）培养[21]。放在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。为了定量负载姜黄素NLC的摄取量，在24 孔板内培养RAW264.7小鼠巨噬细胞（细胞密度为2×105个/孔）24 h后，将培养液换成pH 7.4的新鲜培养液后用NLC样品孵育12 h。然后用PBS冲洗细胞5 次，用体积分数4%的福尔马林溶液处理2 h，用DAPI染色后在荧光显微镜下观察细胞形态，计算荧光强度。

1.4 数据处理与分析

所有实验均进行3 次重复操作，结果以3 个独立实验的平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8.0软件作图，使用SPSS 22.0软件中单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重范围检验对P＜0.05的平均值进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蜂蜡含量对NLC的影响

采用TEM观察NLC的形貌特征，NLC0、NLC5和NLC10均为近似球体的形貌，分布均一，无显著团聚现象（图1A～C）。采用DLS测定了NLC的粒径分布，如图1A～D所示，NLC0、NLC5和NLC10的平均粒径分别为（170.67±2.08）、（207.33±2.52）nm和（256.00±2.00）nm；多分散指数（polydispersity index，PDI）分别为0.12±0.02、0.14±0.05、0.15±0.04，表明NLC粒径随着脂相中蜂蜡含量的增加而增加。这可能是由于当蜂蜡在脂相中的含量较高时，制备冷却过程中脂质相中形成的蜂蜡晶体尺寸较大[22]，导致乳液液滴粒径增大。Zeta电位是表征NLC稳定性的重要指标。由图1E可知，所有NLC的Zeta电位均小于－30 mV，表明其具有良好稳定性。随着蜂蜡在总脂相中的比例增加，NLC的Zeta电位未发生显著变化（P＞0.05），表明蜂蜡含量增加没有显著改变NLC的表面电荷属性和数量。

图1 蜂蜡含量对NLCs结构特性的影响Fig. 1 Effects of beeswax contents on the structural characteristics of NLCs

NLC包封率和负载率是衡量其功能活性物递送效率的重要指标之一[23]。以脂溶性活性物姜黄素为活性物模式物，探究蜂蜡在脂相中的比例对NLC包封率和负载率的影响。由图1A～C、E可知，NLC0、NLC5和NLC10对姜黄素的包封率分别为（87.82±1.32）%、（92.36±1.02）%和（97.27±0.68）%，负载率分别为（1.45±0.01）%、（1.53±0.03）%和（1.61±0.02）%，表明NLC对姜黄素具有良好负载能力和包封效果，且随着蜂蜡比例增加，其负载率、包封率均升高。这是由于NLC制备的冷却过程中，蜂蜡再结晶并以α和β型晶体在MCT液体油中呈现无序分布状态，这种不完美晶体结构使NLC的脂质相具有更大的空间容纳活性物[24]，从而抑制姜黄素外排。此外，蜂蜡含量增大，晶体数量增大，晶体网络结构增强，使得NLC脂质基刚性增强[8]，进一步阻止姜黄素渗漏，提高了姜黄素包封率和负载率。

2.2 蜂蜡含量对NLC储存稳定性的影响

良好的储存稳定性是NLC实现功能活性物质递送的前提[25]。本研究监测了NLC在4 周常温储存过程中的粒径、电位和包封率的变化规律，探究了蜂蜡在脂相中的比例对NLC储存稳定性的影响。由图2可知，NLC0在前3 周常温储存过程中粒径、Zeta电位和姜黄素包封率没有发生显著性变化（P＞0.05），但第4周其粒径和姜黄素包封率显著下降（P＜0.05）。值得注意的是，NLC5和NLC10在4 周常温储存过程中粒径、电位和姜黄素包封率稳定，表明和液体油组相比，添加固体脂质（蜂蜡）可提高纳米脂质载体储存稳定性，这可能是蜂蜡的加入提高了乳液体系的刚性和黏度，脂质相的无序晶型结构稳定，液滴不易发生聚结[26]。相比于纳米乳液（NLC0），蜂蜡基NLC在室温储存过程中物理稳定性更强。

图2 蜂蜡含量对NLCs在4周内的储存稳定性影响Fig. 2 Effects of beeswax content on the storage stability of NLCs within four weeks

2.3 蜂蜡含量对NLC黏度的影响

表观黏度是影响NLC稳定性的关键参数[27]，因此本实验在0～100 s－1的剪切速率变化范围内，监测了NLC在剪切作用下表观黏度的变化。由图3A、B可知，在0～0.5 s－1剪切速率内，NLC5和NLC10的表观黏度随着剪切速率的增加而降低，继而缓慢下降，而后趋于稳定，表明NLC5和NLC10呈现出剪切稀化行为。值得注意的是，在初始剪切速率（0.1 s－1）下NLC0、NLC5和NLC10的表观黏度分别为（0.036±0.001）、（10.220±1.034）Pa·s和（21.490±1.987）Pa·s（图3C），表明蜂蜡的添加显著提高了纳米脂质载体的表观黏度（P＜0.01，P＜0.001），这可能是由于脂质相中的蜂蜡形成了晶体结构，增加了NLC的流动阻力，从而提高了样品的表观黏度[24]。乳液黏度增大使得体系中液滴的运动速度减慢，有利于抑制液滴的絮凝或聚集[28]，这与2.2节中NLC储存稳定性的研究结果相印证。

图3 蜂蜡含量对NLCs表观黏度的影响Fig. 3 Effect of beeswax content on apparent viscosity of NLCs

2.4 蜂蜡含量对NLC小肠黏附渗透特性的影响

小肠是营养活性物的主要吸收场所，因此，探究NLC在肠道的黏附渗透特性非常必要。在本研究中，采用离体小鼠小肠模型[29]测定了游离姜黄素（CON空白对照组）、负载姜黄素的NLC0、NLC5和NLC10在小肠的黏附渗透效率。由图4A可知，CON组小鼠小肠组织未检测到姜黄素荧光信号，表明游离姜黄素在小肠黏膜的黏附和渗透效率很低。负载姜黄素的NLC0、NLC5和NLC10组小鼠小肠组织均检测到强烈的姜黄素荧光信号，表明NLC的引入可显著提高姜黄素在小肠黏膜的黏附和渗透效率，这是由于NLC粒径小，不仅增强了姜黄素在胃肠液中的分散性和溶解性，且增大了比表面积，增强了纳米载体在小肠黏膜的黏蛋白中的吸附效率[30-31]；同时在小肠环境中，NLC的脂解产物（FFA、表面活性剂和溶解的姜黄素）和胆盐被组装成混合胶束和囊泡，形成的胶束和囊泡更容易通过小肠上皮静态水层渗透到黏液底层，从而提高姜黄素在小肠上皮细胞的吸收效率[32]。由图4B可知，NLC0、NLC5和NLC10组的平均荧光信号强度分别为6.072×106、7.303×106和9.413×106，NLC5和NLC10组姜黄素在上皮组织细胞的荧光信号强度比NLC0组分别提高了20.27%和55.02%，表明随着蜂蜡质量分数从0%增加到10%，NLC在小肠的黏附和渗透能力显著增强（P＜0.05，P＜0.01），这可能是由于蜂蜡含量增大有利于提高NLC的黏度，延长了NLC在黏液层的滞留时间，从而提高了可被小肠细胞吸收的姜黄素的浓度[33]。综上，蜂蜡在脂相中的比例是调控姜黄素在小肠黏膜的黏附和渗透效率的关键因素，提高NLC脂质相中的蜂蜡含量可提高其在小肠黏膜中的黏附效率，促进其运载的脂溶性活性物在小肠上皮组织的渗透和吸收。

图4 蜂蜡含量对NLCs在小肠的黏附渗透特性的影响Fig. 4 Effect of beeswax content on the adhesion and penetration efficiency of NLCs in small intestine

2.5 蜂蜡含量对NLC消化释放特性的影响

NLC在胃肠道中消化行为及其对活性物的控制性释放是影响其递送效率和功效发挥的关键因素[34]。NLC0、NLC5和NLC10在体外的释放情况见图5。在模拟胃消化结束后，3 组NLC制剂的姜黄素释放量均小于7%（图5A），表明NLC在胃模拟环境中结构稳定。相比NLC0（（6.39±0.22）%），NLC5和NLC10的姜黄素释放量分别下降至（1.69±0.04）%和（1.58±0.03）%，表明脂质相中蜂蜡含量增加有利于减少姜黄素在模拟胃液中的渗漏。在模拟小肠消化过程中，3 组NLC制剂的姜黄素释放量均明显增大，表明NLC的主要消化部位在小肠。随着固体脂蜂蜡质量分数从0增加至5%再增加至10%，姜黄素释放总量由（99.93±0.09）%降低到（96.38±0.05）%再降低至（90.05±0.05）%，表明增加蜂蜡比例有利于降低疏水性活性物（姜黄素）的释放总量。这可能是由于NLC蜂蜡含量增大，减少了中链甘油三酯与胰脂肪酶接触面积[35]。

图5 蜂蜡含量对模拟消化液中NLCs体外释放行为的影响Fig. 5 Effect of beeswax content on the in vitro release profile of NLCs in simulated digestion fluid

为了进一步探究NLC在小肠环境中的脂解过程，监测了小肠模拟消化过程中FFA的释放情况。如图5B所示，与姜黄素的释放情况类似，在30 min内NLC0组的FFA呈现出突然释放行为，在15 min内释放量达到59.93%，在30 min内释放量大于80%。随脂质相蜂蜡比例的增加，NLC释放速率减缓，30 min内NLC5和NLC10的姜黄素释放量仅为（61.20±2.95）%和（51.30±1.03）%。对FFA释放过程的动态模拟可知，FFA释放速率为KNLC0（0.13 min－1）＞KNLC5（0.08 min－1）＞KNLC10（0.06 min－1）（图5C～E），进一步证实了增加蜂蜡比例可减缓FFA释放速率，即降低NLC脂解效率，从而降低姜黄素的释放量。

2.6 蜂蜡含量对NLC巨噬细胞摄取的影响

巨噬细胞是炎症发生和肿瘤发生发展的主要参与者，是炎症和肿瘤治疗的重要靶点[36]。探究巨噬细胞对不同蜂蜡含量NLC摄取效率的影响，对NLC在抗炎方面的应用具有重要指导作用。如图6A、B所示，游离姜黄素组（CON）显示出的绿色荧光信号微弱，其平均荧光强度为0.98×106，表明RAW264.7小鼠巨噬细胞对游离的姜黄素摄取效率低。而当姜黄素装载到NLC中时，细胞内的绿色荧光强度提高了5.68～6.25 倍，表明NLC增强了小鼠巨噬细胞对姜黄素的吞噬效率。NLC粒径小、比表面积大、在血清培养基中的分散性和溶解性高，生物相容性高，因而有利于其被巨噬细胞吞噬和摄取[37]。值得注意的是，NLC0、NLC5和NLC10组的平均荧光强度分别为6.548×106、6.723×106和7.102×106，各组间不存在显著差异（P＞0.05），表明脂质相中蜂蜡的比例不是影响巨噬细胞吞噬NLC的关键参数。综上，NLC可促进姜黄素在巨噬细胞内的富集，从而有利于其抗炎和抗肿瘤功效的发挥。

图6 蜂蜡含量对NLCs巨噬细胞摄取的影响Fig. 6 Effect of beeswax content on macrophage uptake of NLCs

3 结 论

阐明脂质相组成对NLC的消化释放行为和巨噬细胞摄取的调控作用对于合理设计NLC以实现脂溶性活性物的健康效应最大化具有科学价值。脂质相中蜂蜡的质量比是调控NLCs粒径、负载率、包封率、储存稳定性和剪切黏度的关键控制因素。蜂蜡基NLCs形貌近似球体，粒径小（170.67～256.00 nm），具有良好的姜黄素负载率（＞1.45%）和包封率（＞87.25%）。随着蜂蜡含量增大，其粒径增大，负载率、包封率均有所增加。蜂蜡基NLC乳液体系的刚性和黏度增强，储存稳定性提高。离体肠黏附渗透实验结果表明，蜂蜡含量是调控姜黄素在小肠黏膜的黏附和渗透效率的关键因素，蜂蜡含量增加可提高姜黄素小肠黏膜黏附效率，促进姜黄素在小肠上皮组织的渗透吸收。此外，蜂蜡基NLC促进了姜黄素在巨噬细胞内的富集（相比游离姜黄素组，NLCs组巨噬细胞对姜黄素的摄取效率提高了5.68～6.25 倍）。体外模拟消化释放实验表明，增加蜂蜡含量减缓了FFA释放速率，继而减少了姜黄素释放量。综上，本研究可为蜂蜡基NLCs在脂溶性活性物的消化控制性释放、经小肠黏膜增效吸收和在炎症病灶处巨噬细胞吞噬效率的调控应用提供理论参考。