坏死性凋亡与铁死亡在膝骨关节炎中的研究进展

宗亿洲，戴 易，李 哲，延伟伟，雷茂锟，袁长深，2，段 戡，2

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；2.广西中医药大学一附院东葛院区四肢骨伤科，广西 南宁 530000）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨磨损、韧带损伤、滑膜炎症及关节缘骨赘生成为主要病理特征的慢性退行性疾病。其临床主要表现为关节肿痛、活动受限等不适，严重者可出现膝关节变形甚或肌萎无力［1］。据流行病学统计［2］，KOA 影响了全球约6.5 亿人，其中40 岁以上约占22.9%，并且其发病率与受教育程度呈负相关，给医疗保障系统带来了沉重的负担。目前该病病因尚不明确，多与年龄、体重、创伤及环境变化有关。常用的治疗方法包括适当运动、控制体重、热疗法、消炎止痛、关节注射以及中医手法治疗［3，4］，虽然都具有一定的疗效，但不能从根本上解决问题。疾病容易持续恶化，到了末期多采用关节置换，而这常伴随着手术费用高和术后恢复期长等缺点［5］。因此，探索KOA 新的具体的治疗方案显得尤为重要。最新研究表明［6］，坏死性凋亡和铁死亡是由基因调控的细胞程序性死亡方式，在KOA 的发生发展中发挥着重要的作用，可能是防治KOA 的潜在机制。本文就坏死性凋亡与铁死亡及其在KOA 中的最新研究进行综述。

1 坏死性凋亡与KOA

1.1 坏死性凋亡的概述

坏死性凋亡是一种由受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase3，RIPK3）介导，以混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）为执行蛋白的新型调节细胞死亡方式［7］。它的发生结合了细胞凋亡和细胞坏死的特征，可以在细胞凋亡受阻时被激活，但区别于细胞凋亡［8］。细胞凋亡是第一个被发现的程序性细胞死亡，其形态学表现为细胞浓缩、细胞核破裂、染色质凝结等，常由死亡受体等激发，通过半胱天冬酶介导产生，是为了让生物体获得更大益处而牺牲特定细胞的积极死亡过程［9］。坏死性凋亡则是一种与细胞凋亡共享上游传导信号的非半胱天冬酶依赖性细胞死亡过程，常表现为类似细胞坏死的细胞学变化，如细胞质半透明化、细胞器肿胀、细胞膜破裂及细胞内容物释放等，并且坏死细胞破裂释放的胞内容物会引发强烈的炎症反应，对周围组织产生不利影响［10］。目前比较有效的坏死性凋亡抑制剂是坏死抑素-1（necrostatin-1，Nec-1），它是在其拮抗剂的化学筛查中被首次发现的，可通过抑制RIPK1 的激酶活性来保护细胞免受坏死凋亡［11］。

1.2 坏死性凋亡的产生机制

坏死性凋亡是细胞在环境压力下所产生的一种可调控性反应，通常由多种不同的因素激发，如肿 瘤 坏 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎症因子等，其中以TNF-α 介导的信号通路研究最为深入。当细胞受到外界环境刺激后，诱导坏死性凋亡的TNF-α 释 放 出 来，肿 瘤 坏 死 因 子 受 体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）被激活，TNF-α 与TNFR1 结合并募集RIPK1 等多种蛋白质，在细胞膜上形成复合物I［12］。正常情况下，复合物Ⅰ中的RIPK1 可在经历泛素化修饰后激活核转录因子-kB（nuclear factor -kB，NF-kB）信号通路，进而通过抑制半胱天冬酶-8（caspase-8）的活性来促进炎症产生和维持细胞存活率［7］。而当RIPK1 被去泛素化修饰时，作用于NF-kB 信号通路蛋白的活性降低，RIPK1 从复合物I 中分离出来，与招募的Caspase-8等蛋白形成复合物Ⅱ，共同介导细胞死亡途径。Caspase-8 作为一种调控细胞凋亡和坏死性凋亡的分子开关，在维持机体稳态中扮演着重要角色［13］。当Caspase-8 的活性被激发时，它会通过抑制RIPK1、RIPK3 的活性形成复合物Ⅱa，促使细胞凋亡的发生；而当Caspase-8 的活性受到抑制时，RIPK1、RIPK3 的活性较前增高，从而诱导复合物Ⅱb 形成，使细胞发生坏死性凋亡［14］。

RIPK1、RIPK3 作为坏死性凋亡的特征性蛋白，两者拥有相似的可作为结合位点的RIP 同型结构域（RIP homotypic interaction motif，RHIM）。在坏死性通路中，RIPK1 首先通过磷酸化被激活，继而被激活的RIPK1 通过RHIM 结构域与RIPK3 结合，两者形成RIPK1/RIPK3 复合物，即坏死小体［15］。坏死小体是RIPK3 介导MLKL 的重要平台［16］。随着坏死小体的形成，RIPK3 的磷酸化底物MLKL 被聚集，坏死小体中RIPK3 作用于MLKL，使其形成磷酸化的多聚体并易位到细胞膜以执行细胞坏死。

1.3 坏死性凋亡在KOA 中的应用

人们对坏死性凋亡的研究涉及其产生机理和作用机制，也涉及了其在KOA 中的应用。Jeon等［17］为了研究RIPK3 轴在KOA 发病中的作用，通过手术诱导KOA 小鼠模型并对比RIPK3 表达情况，结果表明在一定范围内KOA 的受损程度与RIPK3 的表达呈正相关，而当使用RIPK3 激酶抑制剂干预时，KOA 的进展被中止，因而RIPK3 激酶抑制剂可能是治疗OA 的潜在临床干预措施。绿唇贻贝（green-lipped mussel ，GLM）是一种天然膳食补充剂，具有改善疼痛和保护关节的功能［18］。研究者为了探索GLM 在KOA 中的作用原理，使其作用于KOA 小鼠并观察相应指标，发现GLM 是通过降低关节中坏死性凋亡介质RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表达水平来发挥保护KOA 的作用［19］。同样，也有研究者在坏死性通路及基因方面找到了治疗KOA的突破口。Zhang［20］和Gong［21］等发现小分子抑制剂VX-11e 及AZ-628 可以通过降低坏死关键蛋白RIPK3、MLKL 的表达来减轻KOA 中软骨细胞坏死性凋亡的发生，进而抑制KOA 关节软骨和软骨下骨的丢失。袁长深等［22］发现基因IL1B、MYC、CYBB 和EGFR 在调控坏死性凋亡中起着关键作用，能够在大鼠KOA 软骨中呈显著差异性表达，这是人们在基因层面上找到治疗KOA 的一种突破，为今后进一步研究及靶向治疗KOA 提供了一种较为可靠的思路。此外，氧化和机械创伤也被证明与骨关节炎中坏死性凋亡有关，根据实验中氧化应激和细胞因子的释放，发现软骨损伤与坏死过程之间可能存在联系，而阻断这些致病的诱发因素和分子机制成为了一种防治骨关节炎的手段，也为治疗KOA 提供了一种重要方法［23］。

2 铁死亡与KOA

2.1 铁死亡的概述

铁死亡是一种由铁积累、脂质过氧化和质膜损伤共同引起的新型调节细胞死亡模式。它的发生由铁依赖性磷脂过氧化驱动，涉及了多种生物学过程，如氧化还原反应，铁代谢、脂质和葡萄糖代谢以及多种与疾病相关的信号传导等［24］。铁死亡具有区别于坏死性凋亡的形态学和病理学特征。在形态学上，铁死亡主要表现为线粒体外膜破裂、线粒体皱缩、线粒体脊减少甚至消失。在病理学上，细胞内脂质过氧化物（lipid peroxidation ，LPO）和铁的增多是铁死亡的主要特点。LPO 作为铁死亡的诱发因素通常是在酯氧合酶、环氧合酶和细胞色素P450 等特定酶作用下形成，当其含量增多时会通过调控脂膜的完整性促使铁死亡发生，而细胞内多余的铁常会通过Fenton 反应介导ROS 的大量产生诱发铁死亡。目前，铁死亡的调节途径大致可分为三类。第一类由谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘 肽 过 氧 化 物 酶 4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）途径调节，该途径可通过对系统Xc-的抑制来减少GSH 的合成，从而抑制GPX4 的活性，使细胞抗氧化能力降低发生铁死亡［25］。第二类由铁代谢的调控机制调节，蛋白酶OTUD1 可以通过调控与铁蛋白活性相关的OTUD1-IREB2-TFRC 通路来增加细胞对铁的吸收，促使细胞产生铁积累［26］。最后，由与脂质代谢的相关途径调节，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 ，ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 ，LPCAT3）可以通过影响多不饱和脂肪酸的活性和跨膜特性来加速细胞中脂质过氧化物的积累和诱导铁死亡的发生［27］。

2.2 铁死亡的产生机制

目前，研究者对铁死亡产生机制的研究以GSH/GPX4 途径介导为主。铁死亡的发生由小分子Erastin 诱发，受到包括GSH 和GPX4 在内的脂质修复酶的潜在调节。GSH 是一种由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽，因为含有巯基结构成为人体内重要的抗氧化剂［28］。Gpx4 是一种以GSH 为底物的经典铁死亡抑制剂，能够还原GSH 将磷脂氢过氧化物转化为脂醇而抑制铁死亡，其活性减少时就会促使铁死亡的发生。当细胞处于炎症刺激、高脂血症或铁超负荷的环境时，位于细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统Xc-会在小分子Erastin的作用下活性下降。正常生理下，系统Xc-会以1∶1的比例通过细胞膜摄入胱氨酸，并排出谷氨酸来维持细胞氧化应激稳定。当系统Xc-的活性受到抑制时，胱氨酸转移到细胞中的速率下降，以胱氨酸为转化原材料的半胱氨酸生成减少，继而GSH 合成下降，Gpx4 表达降低。软骨细胞中ROS 和脂质-ROS不能由GPX4 催化的GSH 还原酶反应途径代谢而积累而发生铁死亡［12］，［29］。

同时外界环境刺激也会促使细胞内游离铁增多诱发铁死亡。当细胞受到外部刺激时，细胞外Fe3+由细胞膜上转铁蛋白受体1 转入到细胞体中，并在金属还原酶前列腺3 的跨膜上皮抗原作用下还原为Fe2+［30］。随后，被还原的Fe2+通过二价金属转运蛋白1 转运到细胞质中的不稳定铁池中。正常生理下，多余的铁会通过铁转运蛋白转运到细胞外，当铁输出机制受损时就会造成细胞内铁积累。

2.3 铁死亡在KOA 中的应用

随着对KOA 研究的深入，铁死亡成为治疗KOA 新 的 突 破 口。Yao 等［31］为 了 研 究 软 骨 细 胞 铁死亡对KOA 的影响，利用白细胞介素-1β 和柠檬酸铁铵对小鼠膝关节软骨细胞诱导并用铁抑素-1（Ferrostatin-1，Fer-1）处理被诱导的细胞，结果表明软骨细胞铁死亡促进了KOA 的进展而Fer-1 可以通过抑制铁死亡来阻止KOA 进程。Zhou 等［32］为了研究具有抗炎效应的D-甘露糖在KOA 中是否干扰软骨细胞铁死亡，将其喂服于发生膝关节软骨变性的小鼠，观察到D-甘露糖可以通过抑制软骨细胞对铁死亡的敏感性来缓解骨关节炎的进展。二甲双胍作为目前治疗2 型糖尿病的一线药物，被多项研究证明具有适度的抗全身性炎症的作用［33］。Yan［34］等为了探究二甲双胍对KOA 软骨细胞铁死亡的影响，使其作用于被诱导铁死亡的软骨细胞，发现关节软骨损害较前减轻与二甲双胍对铁死亡相关蛋白的抑制有关。在中医药方面，温经通络汤作为桂枝加附子汤的衍生方，可通过多种途径调控血管生成进而抑制感觉神经的生长，对缓解KOA 疼痛具有重要的作用［35］。研究者为探究它抑制血管生成的机理，以含药血清作用于脐静脉内皮细胞，发现温经通络汤可通过激活铁死亡通路来减少血管内皮细胞的增殖，也说明了其可以通过调控铁死亡通路来达到治疗KOA 的目的［36］。在基因研究方面，有研究者发现铁死亡相关基因HMOX1在KOA 软骨组织中高表达，并与KOA 的严重程度呈正相关，而寻找抑制基因HMOX1表达的通路成为治疗KOA 的潜在思路［37］。此外，铁螯合剂去铁胺及类胡萝卜素虾青素也被证明可以影响软骨细胞铁死亡的进展，对KOA 软骨细胞具有保护作用，其在关节腔内的应用成为研究者治疗KOA 较好的方案［38，39］。

3 坏死性凋亡与铁死亡之间的联系

坏死性凋亡与铁死亡是具有较高研究价值的程序性细胞死亡，同属于坏死性细胞死亡。它们虽然是两种不同的细胞死亡方式，但在有些方面却有着十分密切的联系。一方面，它们都受线粒体功能的影响。线粒体对调节细胞存活和死亡具有重要作用，其功能通常与ROS 的产生和ATP 的消耗有关，当细胞处于应激状态或受到病理侵袭时，负责调控细胞质基质与线粒体物质和离子交换的通道被抑制，细胞内ATP 被消耗，ROS 产生增加，而产生的ROS 既可以促进RIPK1 的自磷酸化和RIPK3的募集诱导坏死性凋亡的发生，也可以促进脂质过氧化物的积累发生铁死亡［40，41］。另一方面，坏死性凋亡与铁死亡发生过程中都有Ca2+的参与。Ca2+作为机体骨骼发育重要的矿物质元素，对调节机体生长发育和能量代谢具有重要作用。当细胞受到外在异常刺激后，细胞外大量Ca2+因细胞膜上钙离子通道过度激活而内流，同时加上胞内细胞器中Ca2+释放，Ca2+浓度急聚上升，细胞质中过量的Ca2+向线粒体转移使其出现能量供应障碍和氧化应激而出现细胞死亡［42，43］。最后，它们都可以促进机体产生免疫应答反应。坏死性凋亡途径激活后，坏死细胞膜破裂，释放的胞内容物作为DAMPS 刺激周围细胞产生炎症反应，而铁死亡细胞在酯氧合酶和环氧合酶的介导下，通过花生四烯酸代谢也会导致炎性介质释放产生免疫应答反应，同时伴随着大量天然免疫因子释放，如DAMPS 等［44］。

4 坏死性凋亡与铁死亡在KOA 中的应用

关节软骨细胞作为膝关节软骨唯一的细胞成分，其存活对于膝关节的保护具有重要意义；成骨细胞作为关节骨生成的功能细胞，其失调往往会导致关节骨质增生或骨关节的退化；两者均为膝关节重要的组成部分，当其正常工作时才能防止膝关节病变［45，46］。既往研究者发现关节软骨细胞可以在铁积累环境下通过产生过多的ROS 来诱发铁死亡，最新研究证明成骨细胞内过量的铁诱导ROS 增多后也可以导致坏死性凋亡的发生，其机理主要是细胞内过多的ROS 能够激活RIPK1/RIPK3 通路，使细胞内RIPK1、RIPK3 表达增加［31，47］。因而，坏死性凋亡与铁死亡均可以在铁积累和ROS 增多时介导膝关节病变，而对这两种共同的诱发因素的抑制可能是防治KOA 的重要方法。此外，中科院有研究者通过化合物及基因筛查等方法研究细胞坏死性凋亡与铁死亡之间的共同调控机制时，发现加入坏死性凋亡细胞中的小分子2-氨基-5-氯-N，3-二甲基苯甲酰胺（2-amino-5-chloro-N，3-dimethylbenzamide，CDDO）可以通过抑制热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）的活性来抑制RIPK1 激酶活性，从而降低RIPK1、RIPK3 和MLKL 的磷酸化，减少坏死性凋亡的发生，而在铁死亡通路中，CDDO 通过抑制HSP90 的活性来抑制自噬的发生，从而减少GPX4 的降解来抑制铁死亡［48］。因此，小分子CDDO 能够以蛋白质HSP90 为媒介对这两种死亡方式进行有效的控制，对于KOA 中同时存在坏死性凋亡和铁死亡时它的相关药物及其他HSP90 抑制剂成为较为合适的选择。

5 总结及展望

KOA 是临床中常见的肌肉骨骼疾病，其致病因素复杂多样，困扰了许多中老年人。目前的治疗方法虽然较多，却很难有根治之法。随着坏死性凋亡和铁死亡的研究出现，一些新的发现为KOA 的治疗开扩了新领域，如RIPK3 激酶抑制剂、GLM、Fer-1、D-甘露糖等成为治疗KOA 的新的切入点。特别是对坏死性凋亡和铁死亡的联合研究，证明两者之间也存在相同的产生因素和作用靶点，为单一药治疗两种甚至多种因素导致的KOA 提供了方向。坏死性凋亡与铁死亡是各具特点又相互联系的两种新型细胞死亡方式，由外在小分子研究到信号通路的探讨再到基因靶点的研究，都是KOA 治疗研究上的进一步深入，为研究者防治KOA 的提供了一些科学理论上的支撑。但应认识到对于坏死性凋亡和铁死亡治疗KOA 的研究目前还欠完善，一些相关性研究还处于动物实验阶段，缺乏临床人体实验的证实，并且对如何通过两种程序性死亡方式来防治KOA 的具体药物未见报道。此外，不同的细胞死亡模式之间是有一定的联系的，对于不同抑制剂是否能联合应用及使用后的效果还有待科学的实验证明。因此，需要持续的研究来为KOA 的治疗提供可行的方法和更多的循证依据。

作者贡献度说明：

宗亿洲：文献查找和文章书写；戴易、李哲、延伟伟、雷茂锟：文章内容修改；袁长深、段戡：文章构思。

所有作者声明不存在利益冲突关系。