不同来源的苹果醋理化指标、抗氧化活性和风味特性分析

李雅楠，张晓娟，董艳林，柴丽娟，陆震鸣，史劲松，许正宏*

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122；3.江南大学 生命科学与健康工程学院，江苏 无锡 214122；4.绿杰股份有限公司，山东 烟台 264010）

苹果醋是由苹果或苹果加工副产物经过酒精发酵和醋酸发酵两步生产的，苹果醋在美国、澳大利亚、法国、英国等地的食用历史悠久，生产规模大，产品种类多，经常作为酸性调味品、饮品和家用健康辅助产品被广泛接受[1]。苹果醋的主体发酵代谢产物为乙酸，此外还苹果醋中含有氨基酸类、有机酸类、酚类、黄酮类等成分，这些物质一部分来源于苹果原料，而另一部分则是通过微生物的代谢或者由微生物中的酶催化产生的[2-3]。前期研究表明，苹果和苹果醋还富含酚酸类衍生物和其他类黄酮类物质[4-5]，这些物质具有较强的抗氧化能力和免疫调节能力[6-8]，如绿原酸、咖啡酸和儿茶素等，从而对降低血糖和血脂、治疗糖尿病和减肥有积极作用[9-10]。氨基酸和有机酸是苹果醋中重要的营养成分和调味物质，会对苹果醋的滋味特征产生显著影响，其中苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等非挥发性有机酸可以降低醋酸的刺激性，平衡挥发性酸和非挥发性酸的比例，使酸味更加柔和醇厚。苹果醋的挥发性香气成分苯乙醇、辛酸、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异戊醇等赋予了苹果醋花香和果香的特征[11-12]。

我国苹果醋生产企业主要集中分布在河南、山东、河北和陕西等省[13]。但由于苹果原料品质、发酵菌种和工艺等条件的差异，不同产地及不同企业生产的的苹果醋在风味特性、营养特性等方面差异显著，这些差异的本质是由于不同的苹果醋中各类物质含量不同导致的，其中，有机酸、氨基酸和挥发性物质含量等多元的指标共同决定了苹果醋的理化和风味特性，而总多酚和总黄酮等物质的含量指标决定了苹果醋的抗氧化活性。研究不同来源苹果醋的理化指标、氨基酸、有机酸、挥发性物质和抗氧化活性指标的异同，对建立苹果醋的理化特性研究或鉴别方法具有重要意义。

该研究以来自国内外不同产地及不同企业的19份苹果醋样品为研究对象，测定其理化指标、氨基酸、抗氧化活性、有机酸和挥发性物质，同时对这些苹果醋理化和风味特性的异同点进行了比较，并通过相关性分析及主成分分析对影响不同来源苹果醋品质的特征指标进行筛选确定，为苹果醋理化和风味品质评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 苹果醋样品

采集不同来源的苹果醋共19份，分别来自国内外不同地域及不同厂家，部分苹果醋样品为浑浊状态。苹果醋样品编号见表1。

1.1.2 试剂

苯酚、浓硫酸、肌酸、萘酚、硫酸锌、亚铁氰化钾、甲醇、磷酸二氢钠、醋酸钠、碳酸钠、芦丁、福林酚、亚硝酸钠、硝酸铝、正丙醇氢、氧化钠、硫酸锌、三乙胺、四氢呋喃、氢氧化钠、亚铁氰化钾、乙腈（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；叔戊醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、胱氨酸、精氨酸、异亮氨酸等（均为色谱纯）：美国Sigma Aldrich公司；乳酸、葡萄糖标准液：山东省科学院生物研究所；蒸馏水：娃哈哈公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪SpectraMax M2：美国Molecular Devices公司；Waters e2695高效液相色谱仪、Waters Atlantis T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱：美国Waters公司；5810R台式高速冷冻离心机：Eppendorf公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；RA-250WE 折光仪：日本京都公司；Agilent HP-5毛细管柱和萃取头、Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent Hypersil ODS柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）：中国上海安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标测定

总酸：采用滴定法，参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》进行测定[14]；有机酸：采用高效液相色谱法，参照GB/T 18623—2011《国家地理标志产品镇江香醋》进行测定[15]；可溶性固形物：采用RA-250WE 折光仪在20 ℃下测定；还原糖：按照比色法，参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》进行测定[16]。

1.3.2 总多酚含量测定

总多酚含量测定采用比色法，参考KWAW E等[17-18]的方法，取200 μL稀释后的样品，分别加入1.0 mL福林酚试剂，1.0 mL Na2CO3溶液，并用蒸馏水定容至4 mL，常温避光静置30 min，于酶标仪波长765 nm处测定吸光度值，试剂空白为参比。总多酚含量（以没食子酸计）根据标准曲线方程计算总多酚含量。

1.3.3 总黄酮含量测定

总黄酮含量测定采用比色法，参考LI H C等[19]的方法，分别精密量吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL芦丁标准液，添加0.15 mL亚硝酸钠溶液静置6 min，0.15 mL硝酸铝溶液静置6 min，2 mL NaOH溶液，最后加水定容至5 mL，振荡混匀，静置3 min，于酶标仪波长508 nm处测定吸光度值，根据芦丁溶液浓度和吸光度值绘制标准曲线。取0.5 mL待测样品，依次加入各溶液，在波长508 nm处测吸光度值，根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量。

1.3.4 氨基酸含量测定

将发酵液样品12 000 r/min离心5 min获得上清液。准确量取2 mL发酵上清液，添加2 mL 10%三氯乙酸等体积混合均匀，静置2 h后用双层滤纸过滤，取滤液1 mL于1.5 mL离心管内，离心后吸取上清液待分析。

采用高效液相色谱法，色谱分析条件[20-21]：色谱柱：Agilent Hypersil ODS柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相：流动相A（pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃（体积比为500∶0.11∶2.5），流动相B（pH=7.2）：80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈（体积比为1∶2∶2）；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：发射波长340 nm、激发波长450 nm。

1.3.5 抗氧化能力检测

亚铁还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的测定：依据BENZIE I F F等[22]的方法；1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl；DPPH）自由基清除能力的测定：依据RAMIREZ J E等[23-24]的方法；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS+）自由基清除能力测定：依据TAO Y等[25-26]的方法。

1.3.6 挥发性风味物质测定

（1）顶空固相微萃取条件

取6 mL发酵液样品于20 mL样品瓶中，并加入2.5 gNaCl促进挥发，加入10 μL叔戊醇（8.05 g/L）作为内标，在40 ℃仪器的加热平台上平衡10 min，将萃取头插入250 ℃的GC进样口老化30 min，然后插入已平衡好的样品瓶中吸附。吸附完成后，插入GC进样口，进行解吸[27]。

（2）气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：Agilent HP-5毛细管柱，氦载气流速1.2 mL/min，进样口温250 ℃，分流比60∶1。升温程序为：起始温度40 ℃，维持2 min后以3 ℃/min速率增加至130 ℃，再以6 ℃/min速率升温至200 ℃，最后以15 ℃/min速率升温至230 ℃，维持8 min。

质谱条件：接口温度250 ℃，电离方式是电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，捕获方式为全扫描（25～350 m/z）[28]。

定性定量方法：对检测出的成分采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11数据库自动检索化合物的质谱数据，参考标准光谱图进行定性分析；采用内标法定量。

1.3.7 数据分析

采用Microsoft Excel 2010、MassHuter和SPSS 26.0进行数据处理，采用Metabo Analyst在线工具进行聚类[29]。所有检测均进行3次重复实验。

2 结果与分析

2.1 不同来源的苹果醋理化指标比较

总酸、还原糖和可溶性固形物是食醋及苹果醋发酵中很重要的指标，国内外苹果醋样品的理化指标检测结果见图1。

图1 国内外苹果醋的理化指标Fig.1 Physicochemical indexes of domestic and foreign apple cider vinegar

由图1可知，所有苹果醋样品的总酸范围在4.0～8.3 g/100 mL，国内苹果醋样品的总酸相对略低，但是组内的差异较大，总酸平均值在5.4 g/100 mL。国外苹果醋作为复合调味料中一味成分的使用场景更加普遍，因此整体产品的总酸较高，总酸平均值为6.3 g/100 mL。所有苹果醋样品的还原糖含量范围在2.0～12.8 g/L，国内苹果醋样品的还原糖含量平均值为5.3 g/L，其中部分国内苹果醋样品还原糖含量较高，而国外苹果醋样品的还原糖含量平均值为3.6 g/L。可溶性固形物含量的结果与还原糖结果类似，所有苹果醋样品可溶性固形物含量范围在3～35°Bx，其中国内少数苹果醋样品可溶性固形物含量较高，最高的可以达到30°Bx以上。结果表明，苹果醋样品的总酸的范围为4.0～8.3 g/100 mL，还原糖含量的范围为2.0～12.8 g/L，可溶性固形物含量的范围为3～35°Bx。在参试苹果醋样品中，国外苹果醋样品总酸相对较高，还原糖含量较低，国内苹果醋样品总酸相对较低，还原糖含量较高。

2.2 不同来源的苹果醋抗氧化性比较

国内外19个苹果醋样品的抗氧化性检测结果见图2， 总多酚和总黄酮含量测定结果见图3。

图2 不同来源的苹果醋（A）及清浊汁样品（B）抗氧化能力分析Fig.2 Antioxidant activity of apple cider vinegar from different sources(A)and clear and turbid samples(B)

图3 不同来源的苹果醋总多酚（A）和总黄酮（B）含量分析Fig.3 Total polyphenols (A) and total flavones (B) contents of apple cider vinegar from different sources

由图2A可知，整体样品的ABTS自由基清除率呈现出跨度较大的数据分布。所有苹果醋样品的ABTS自由基清除率范围是7.4%～91.0%，其中国内苹果醋样品的ABTS自由基清除率平均值为56%，国外苹果醋样品的ABTS自由基清除率平均值为41%，国内苹果醋样品ABTS抗氧化能力略高于国外；国内、国外样品的DPPH自由基清除率平均值在50%以内且差异不显著（P＞0.05）；所有苹果醋样品FRAP值范围为0.25～2.0 mmol Trolox/L，其中国内苹果醋样品FRAP值平均为0.4 mmol Trolox/L，国外苹果醋样品FRAP值平均为0.8 mmol Trolox/L，国外苹果醋样品FRAP抗氧化能力略高于国内。为了具体考察未过滤样品是否在抗氧化性质方面具有共性的特征，将未过滤的样品归为一组，与过滤样品进行比较，而其他清汁苹果醋样品归为一组，结果见图2B。

由图2B可知，浊汁苹果醋样品的ABTS、DPPH和FRAP抗氧化能力皆极显著或非常显著高于清汁样品（P＜0.01或P＜0.001）。这可能是由于浊汁苹果醋中存在的菌株或沉淀的代谢产物具有更强的抗氧化活性。

由图3可知，国内外苹果醋样品的总多酚和总黄酮含量基本处于0.04～0.36 mg/mL的范围内且差异显著（P＜0.05）。

结果表明，国内苹果醋样品ABTS抗氧化能力略高于国外，而国外苹果醋样品FRAP抗氧化能力略高于国内，浊汁苹果醋样品的ABTS、DPPH和FRAP抗氧化能力皆极显著高于清汁样品（P＜0.01），所有苹果醋样品DPPH自由基清除率无显著差异（P＞0.05），总多酚和总黄酮含量差异显著（P＜0.05）。

2.3 不同来源的苹果醋氨基酸组成分析

对不同来源苹果醋的氨基酸组成进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），得到的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1的氨基酸，结果见图4和图5。

图4 不同来源的苹果醋氨基酸含量分析结果（VIP＞1）Fig.4 Analysis results of free amino acids in apple cider vinegar from different sources (VIP＞1)

图5 不同来源的苹果醋氨基酸含量分析结果Fig.5 Analysis results of free amino acids in apple cider vinegar from different sources

由图4可知，所有苹果醋样品的氨基酸总含量在15～300 mg/L的范围内，其中国内样品的氨基酸总含量（平均160.2 mg/L）较国外样品（平均83.8 mg/L）高。从所有样品中17种氨基酸的累积总含量的结果看，苹果醋样品中天冬氨酸和丙氨酸含量普遍偏高，平均含量分别为45 mg/L和28 mg/L，而半胱氨酸和丝氨酸的含量较低，平均含量分别为20 mg/L和40 mg/L。将17种氨基酸按滋味分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和无味氨基酸，大部分苹果醋样品中甜味氨基酸和苦味氨基酸含量较高，无味氨基酸含量最低。所有苹果醋样品的苦味氨基酸含量基本处于100 mg/L范围内且含量平均值为53.96 mg/L，甜味氨基酸含量在200 mg/L范围内且含量平均值为58.17 mg/L；无味氨基酸在6 mg/L以内且平均值为1.43 mg/L。这可能是在醋酸发酵过程中醋酸菌将苹果汁中的天冬氨酸和谷氨酸进行了近一步的转化，转化趋于甜味氨基酸和苦味氨基酸方向。

由图5A主成分分析结果可知，国内外苹果醋样品主体氨基酸组成有差异，经过PLS-DA分析发现，造成一些样品之间差异的氨基酸为蛋氨酸和脯氨酸（图5B），大多数国内苹果醋样品组内的氨基酸含量差异较小，国外苹果醋样品组内的氨基酸含量差异较大，F1、F2、F3和F4的蛋氨酸和脯氨酸含量较高，但是F5、F6、F7和F8的蛋氨酸和脯氨酸含量较低。由图5C的主成分分析结果可知，浊汁和清汁的苹果醋样品的主体氨基酸组成有差异，经过PLS-DA分析谷氨酸和天冬氨酸是造成浊汁和清汁苹果醋样品差异的主要氨基酸（图5D），清汁苹果醋样品的谷氨酸和天冬氨酸含量皆较高，而浊汁苹果醋样品的谷氨酸和天冬氨酸含量较低。总而言之，苹果醋样品的氨基酸总含量在15～300 mg/L的范围内，其中国内样品的氨基酸总含量平均值相对较高。天冬氨酸和丙氨酸是苹果醋含量较高的氨基酸，蛋氨酸和脯氨酸是部分国内外苹果醋样品的差异氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸是清汁和浊汁苹果醋样品的差异氨基酸。

2.4 不同来源的苹果醋有机酸组成分析

不同来源的苹果醋有机酸含量检测结果见图6A，国内外醋样以及清浊汁醋样的PCA结果见图6B和图6C。

图6 不同来源的苹果醋有机酸含量分析结果Fig.6 Analysis results of organic acid in apple cider vinegar from different sources

由图6A可知，国内外苹果醋样品的有机酸总含量基本相似，总含量大致都在20～40 g/L的范围内，其中样品Q8和F8的有机酸总含量最高，皆达到40 g/L左右，两个样品的酒石酸和乙酸含量都较其他样品高。大多数苹果醋样品都含有莽草酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸和乙酸。其中，苹果醋样品的草酸和丙酮酸含量都在0.02～0.03 g/L左右，酒石酸和奎宁酸含量都在0.1～0.2 g/L左右，苹果酸和乳酸的含量都在0.5～1 g/L左右，乙酸含量都在25 g/L左右，柠檬酸和琥珀酸含量都在0.1～0.4 g/L左右。综上结果表明，乙酸是苹果醋的主体有机酸，除了乙酸以外，苹果醋样品中乳酸、苹果酸和琥珀酸的含量较高，而莽草酸和丙酮酸的含量较低。由图6B可知，国外样品的分布较为集中，说明国外样品组内差异较小，有机酸的组成和含量相对较为相似，国内样品的分布较为分散，样品组内差异较大，有机酸的组成和部分有机酸的含量存在差异，这可能是由于不同样品的发酵生产过程和原料不同造成的，其中乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和草酸是造成差异的有机酸。由图6C可知，浊汁苹果醋样品的分布较为集中，样品组内差异较小，有机酸的组成和含量相对较为相似，而清汁的苹果醋样品分布较为分散，说明清汁样品组内有机酸的组成和部分有机酸的含量存在差异，如清汁样品之间乙酸和莽草酸的含量差别较大。综上结果所示，在有机酸组成方面，国外苹果醋样品组内差异较小，国内苹果醋样品组内差异较大，造成差异的有机酸为乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和草酸；浊汁苹果醋样品组内差异较小，清汁苹果醋样品组内差异较大，造成差异的有机酸为乙酸和莽草酸。

2.5 不同来源的苹果醋挥发性风味物质检测

不同来源的苹果醋挥发性风味物质检测结果见图7，国内外醋样以及清浊汁醋样的PCA结果见图8。

图7 不同来源的苹果醋挥发性风味物质含量测定结果Fig.7 Detection results of volatile flavor compound in apple cider vinegar from different sources

图8 不同来源的苹果醋挥发性风味物质分析结果Fig.8 Detection results of volatile flavor compound in apple cider vinegar from different sources

由图7可知，苹果醋的挥发性风味物质主要检测到醇类、酯类、酸类、酚类和醛类等物质，所有苹果醋样品的挥发性风味物质总含量基本相似，酸类、酯类和醇类物质占比较高。从每一类挥发性物质的所有样品累积总含量的结果可知，酸类、酯类和醇类物质含量较高。酸类物质中乙酸、辛酸和异戊酸的含量最高，其中乙酸和异戊酸具有一定的刺激味道，而辛酸则为水果味；酯类物质中乙酸乙酯、乙酸异戊酯和琥珀酸二乙酯的含量最高，乙酸乙酯可以为苹果醋带来一些果香风味，乙酸异戊酯则可以赋予苹果醋香蕉般的果味；醇类物质中苯乙醇、异戊醇的含量最高，其中苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气，异戊醇则赋予苹果醋辛辣味。

由图8A可知，国内和国外苹果醋样品的分布都较为分散，说明国内外样品之间的风味差异较大，这些差异也可能是由于不同样品的发酵方式不同或者原料不同造成的。由图8B可知，国外浊汁样品F5、F6和F7分布较为紧密，说明浊汁苹果醋样品的挥发性物质组成和含量较相似，而清汁样品的分布较分散，其挥发性物质组成和含量差异较大，不同样品的风味较为不同，通过近一步的分析发现，3,5-二甲基苯甲醇、醋酸乙烯酯和异戊酸是形成浊汁和清汁苹果醋样品差异的挥发性物质（见图8C），同时也是形成清汁苹果醋样品组内差异的物质。综上结果可知，苹果醋的挥发性物质主要检测到醇类、酯类、酸类、酚类和醛类等物质，所有苹果醋样品的挥发性物质总含量基本相似，酸类、酯类和醇类物质占比较高。乙酸、辛酸、异戊酸、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、琥珀酸二乙酯、苯乙醇和异戊醇是苹果醋样品中含量较高的挥发性物质，不同的发酵方式及原料使国内外苹果醋样品组间及清汁苹果醋样品组内的风味差异较大。

2.6 相关性分析

不同来源的苹果醋理化指标相关性测定结果见图9。

图9 不同来源的苹果醋理化、抗氧化活性和风味特性指标相关性分析结果Fig.9 Correlation analysis results of physicochemical indexes,antioxidant activity and flavor characteristics of apple cider vinegar from different sources

由图9可知，苹果醋样品各理化指标间共有36个相关系数，α=0.05水平上存在显著相关性的有3个，在α=0.01水平上存在显著相关性的有5个。还原糖和DPPH自由基清除率（0.54）、多酚（0.77）、氨基酸总含量（0.58）呈极显著正相关（P＜0.01）；可溶性固形物和ABTS自由基清除率呈显著正相关（0.49）（P＜0.05）；DPPH自由基清除率和总多酚含量呈极显著正相关（0.86）（P＜0.01）、总黄酮含量（0.46）呈显著正相关，还原力和总黄酮呈极显著正相关（0.58）（P＜0.01），ABTS自由基清除率和总黄酮呈极显著正相关（0.67）（P＜0.01）；苹果醋的总多酚和总黄酮含量会影响苹果醋的抗氧化性。

3 结论

本研究通过对比19个不同来源的苹果醋样品在有机酸、氨基酸、总酸、挥发性物质、抗氧化性等方面组成差异，基于多重比较和相关性分析对不同来源苹果醋品质进行评价并筛选特征指标，通过比较得知，不同的苹果醋样品在理化、抗氧化活性和风味品质指标上均存在一定的差异。结果显示，在参试苹果醋样品中，国外样品的总酸含量和DPPH自由基清除率较国内样品高，还原糖含量和ABTS抗氧化活性较国内样品低；与国外样品相比较，国内样品的氨基酸总含量较高，其中天冬氨酸和丙氨酸是苹果醋含量较高的氨基酸，蛋氨酸和脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸分别是国内外样品和清浊汁样品的差异氨基酸；乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和草酸是国内样品组内差异有机酸，乙酸和莽草酸是清汁样品组内差异有机酸；所有样品的挥发性物质总含量基本相似，酸类、酯类和醇类物质含量较丰富，乙酸、辛酸、异戊酸、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇和异戊醇等是样品中含量较高的挥发性物质；相关性结果显示，苹果醋中总多酚和总黄酮含量与抗氧化活性呈极显著正相关（P＜0.01）。该研究确定了苹果醋的主体氨基酸、有机酸以及特征挥发性风味物质，为苹果醋风味评价及建立部分品质指标提供了理论依据。