弓形虫LAMP荧光检测方法的建立与应用

杜鹃，吴迪，张玮，程敏姮，李蕊，李刚，陈会玲，王天梓，苗东影，王林*

(1. 北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629；2. 北京市大兴区农业农村局检测检疫和疫病防控中心，北京 102629)

弓形虫病是由原生动物寄生虫刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种人畜共患传染病[1]，可感染所有温血动物[2]，我国将其列为三类动物疫病[3]。猫科动物是弓形虫唯一的终末宿主，被感染的猫能够在感染后的几天内在粪便中排出数百万个感染性卵囊[4-5]。人类、啮齿动物和其他动物作为中间宿主，通过摄入来自环境中的卵囊，即食用受污染的食物、含有弓形虫的未煮熟的肉或直接接触猫粪便排出的卵囊而被感染[6-7]。流浪犬在人类弓形虫病流行病学中的作用也不可被低估，因为它们经常接触受污染的环境，可以很容易地作为弓形虫的传播载体[8]。弓形虫侵入动物机体后，可经血流输送至各器官，寄生在这些器官细胞中，并加速分裂增殖，导致组织炎症、水肿、炎性细胞浸润、坏死。犬感染弓形虫后可出现发热、肌肉麻痹、昏睡及角弓反张等症状，猫感染后不会有明显的临床症状[9]。据统计，世界上30%[10]的人感染弓形虫，其中，中国有7.88%[11]的人口感染过弓形虫。目前弓形虫检测方法分为病原分离鉴定、聚合酶链反应(PCR)与酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但病原分离鉴定操作复杂、对实验室要求高，传统PCR检测灵敏度低、易污染，免疫学检测可能存在假阳性等问题[12]，因此亟需建立一种快速、准确、不易污染、仪器设备适配性高的检测方法。

环介导等温扩增检测方法(LAMP)是一种新型的体外等温扩增核酸检测技术[13]，该方法针对靶基因的6个特定区域设计4种特异性引物[14]，在链置换脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶作用下，可实现在15～60 min，60～65 ℃条件下完成109～1010倍的扩增反应[15]，是一种快速、无污染、准确的新型核酸扩增方法。本研究建立了一种基于SYTO9荧光染料的弓形虫LAMP荧光检测方法，可通过荧光曲线判读结果，无需开盖电泳，具有灵敏度高、特异性强、仪器设备适配范围广等优点，适合现场快速检测。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及试剂

LoopampDNA 扩增试剂盒购自荣研生物科技(中国)有限公司，弓形虫实时荧光定量PCR检测试剂盒(批号：TOX20220809P)购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。弓形虫、血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体核酸，由北京市动物疫病预防控制中心保存。弓形虫基因组质粒由中国农业大学馈赠，质粒浓度为450 ng/μL。SYTO9荧光染料购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 仪器设备

便携式MA-1610型等温荧光PCR仪购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司。QuantStudio7荧光定量PCR仪器购自ABI公司，UNOП基因扩增仪购自德国Whutmun，移液器购自德国Eppendorf公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已发表弓形虫特异基因片段(GenBank：AF146527)，运用PrimerExplorer 在线生物软件(http：//primerexplorer.jp/)，通过调整GC含量、Tm值、dG临界值等参数值，设计出2组LAMP荧光检测的引物组，包括基础引物(F3、B3、FIP、BIP)和环引物(LB)，引物序列见表1和表2。根据《动物弓形虫病诊断技术》(NY/T 573—2022)中聚合酶链式反应(PCR)提供的引物进行引物序列合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物组1序列

表2 引物组2序列

1.4 LAMP反应体系的建立与优化

按照LoopampDNA 扩增试剂盒说明书配制25 μL LAMP反应体系，见表3。

表3 LAMP荧光反应体系

1.4.1 引物组的筛选

将450 ng/μL浓度弓形虫基因组质粒稀释为104copies/μL，并以此为模板利用引物组1与引物组2进行LAMP荧光扩增反应，比较两组引物组荧光曲线、扩增反应时间，筛选出最优引物组。

1.4.2 反应温度筛选

以104copies/μL浓度弓形虫基因组质粒为模板，利用MA-1610型等温荧光PCR仪分别在反应温度为62、64、66、68 ℃的条件下进行LAMP荧光扩增反应，比较各反应温度下的扩增反应时间。

1.5 灵敏度试验

将450 ng/μL弓形虫基因组质粒稀释为104copies/μL，定量后将总DNA按1∶10进行倍比稀释至0.1 copies/μL，并使其最终稀释拷贝数为104copies/μL～10-1copies/μL，并以ddH2O作为阴性对照，使用MA-1610型等温荧光PCR仪与荧光定量PCR仪进行LAMP荧光反应，评价建立方法的灵敏度。同时，将建立的LAMP荧光检测方法灵敏度与中华人民共和国农业行业标准：《动物弓形虫病诊断技术》(NY/T 573—2022)中规定的PCR检测方法与某一市售的弓形虫实时荧光定量PCR检测试剂盒(Ct值<36并出现特定扩增曲线判定为弓形虫阳性，无Ct值或无特异性扩增曲线判为阴性)进行比对。

1.6 特异性试验

以弓形虫阳性样品，血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体核酸为模板进行LAMP特异性检测，评价LAMP荧光检测特异性。

1.7 重复性试验

分别以浓度为104copies/μL～1 copies/μL的弓形虫基因组质粒为模板，进行LAMP荧光扩增，每个稀释度重复4次，根据其Ct值计算变异系数，评价该方法的重复性。

1.8 仪器设备适配性试验

将104copies/μL弓形虫基因组质粒，按1∶10倍比稀释至0.1 copies/μL，分别应用QuantStudio7荧光定量PCR仪与MA-1610型等温荧光PCR仪进行LAMP荧光扩增反应，开机预热并检验仪器性能后，取配制好体系的PCR反应管，放置在样品槽相应位置，记录顺序，按表4设置扩增参数，进行LAMP扩增。

表4 仪器LAMP扩增参数

1.9 临床样品检测

用已建立的LAMP荧光检测方法、市售的实时荧光定量PCR试剂盒及《动物弓形虫病诊断技术》(NY/T 573—2022)中规定的PCR检测方法，同时检测已知背景的200份临床样品(其中190份为阴性样品，10份为阳性样品)，临床样品根据《北京市动物疫病监测与流行病学调查计划(2021—2025)》采集全市动物医院、散养户、流浪场所等犬、猫粪便与全血样品，比对3种检测方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 引物组合的筛选

设计的弓形虫引物组1与引物组2 LAMP荧光扩增反应结果见图1。可以看出，引物组1扩增反应时间为11 min，引物组2扩增反应时间为16 min，因此引物组1优于引物组2。

1. 引物组1扩增反应曲线；2. 引物组2扩增反应曲线；3. 引物组1阴性对照；4. 引物组2阴性对照。

2.2 反应温度的筛选

不同反应温度条件下扩增曲线见图2。可以看出，62 ℃条件下扩增时间为12 min，64 ℃条件下扩增时间为19 min，66 ℃条件下扩增时间为21 min，68 ℃条件下扩增时间为32 min，因此弓形虫LAMP荧光检测反应条件最佳温度为62 ℃。

A. 62 ℃；B. 64 ℃；C. 66 ℃；D. 68 ℃。

2.3 灵敏度试验

评价确定所建立的LAMP荧光检测方法的灵敏度，检测结果如图3、图4所示，可检测到1 copies/μL。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，样品在529 bp出现条带即为阳性，检测结果如图5所示，可检测到100 copies/μL。应用弓形虫实时荧光定量PCR检测试剂盒进行扩增反应，判定标准为Ct值<36并出现特定扩增曲线判定为弓形虫阳性，无Ct值或无特异性扩增曲线判定为阴性，检测结果如图6所示，可检测到10 copies/μL。建立的LAMP荧光检测方法灵敏度高于标准方法与市售某一实时荧光定量PCR检测试剂盒。

1～6.不同稀释浓度质粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 阴性对照。

1～6. 不同稀释浓度质粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 阴性对照。

M. DNA分子量标准(DL2000)；1～6. 质粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 阴性对照。

1～6. 质粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 阳性对照；8. 阴性对照。

各检测方法灵敏度比较结果见表5。

表5 弓形虫各检测方法灵敏度比较

2.4 特异性试验

本研究建立的弓形虫LAMP荧光检测方法特异性结果见图7。可以看出，建立的LAMP荧光检测方法特异性良好，可以特异性检出弓形虫，与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体无交叉反应。

1.弓形虫；2. 血吸虫；3. 猫弓首蛔虫；4. 犬巴贝斯虫；5. 犬新孢子虫；6. 钩端螺旋体；7-8. 阴性对照。

2.5 重复性试验

采用104copies/μL～1 copies/μL的弓形虫基因组质粒为模板进行实时荧光LAMP扩增，每个稀释度重复 4 次，结果如表6所示，变异系数均小于5%，说明该方法重复性较好。

表6 ASFV荧光LAMP重复性验证

2.6 仪器设备适用性试验

分别使用MA-1610型等温荧光PCR仪与ABI QuantStudio7荧光定量PCR仪对104copies/μL～0.1 copies/μL质粒进行扩增，检测结果见表7。在50 min内两种设备均可检测到1 copies/μL，表明本研究建立的弓形虫LAMP荧光检测方法对两种型号的PCR检测设备均可适用，既可应用于实验室QuantStudio7荧光定量PCR仪，又可应用于现场检测设备MA-1610型等温荧光PCR仪，且检测结果稳定。

表7 仪器设备适用性试验结果

2.7 LAMP荧光的临床检测

用已建立的LAMP荧光检测方法与市售的弓形虫实时荧光定量PCR检测试剂盒、行业标准(NY/T 573—2022)同时检测已知背景的200份临床样品(其中190份为阴性样品，10份为阳性样品)，比对3种检测方法的符合率，结果见表8。可以看出，建立的LAMP荧光检测方法与实时荧光定量PCR方法、行标方法检测结果一致，三者符合率为100%。

表8 LAMP荧光、实时荧光定量PCR、普通PCR检测结果

3 讨论

传统的弓形虫病诊断方法依赖于特异性抗体的血清学检测，然而这种方法有其局限性[16]，在感染的活跃阶段，可能无法检测到特异性的抗弓形虫IgG或IgM，因为这些抗体可能直到寄生虫血症发生几周后才能产生[17]。分子法检测弓形虫感染具有较高的灵敏度和特异性，具有一定优势。一些基于PCR的弓形虫检测技术已经被开发，然而由于PCR仪器的昂贵成本和反应时间长，这些技术在临床使用中存在一些局限性[18]。本研究建立的LAMP荧光检测方法具有灵敏度高、特异性强、仪器适用范围广等优点，可以很好地弥补PCR检测方法的劣势。

本研究选取弓形虫基因片段(NCBI GenBank：AF146527)为模板进行引物设计，该基因片段大小为529 bp，在刚地弓形虫基因组中重复200～300次，是一段高度保守的重复序列，通常被用作弓形虫PCR诊断。Du等[19]分别利用弓形虫529 bp重复片段(AF146527)与B1基因(AF179871)为模板进行PCR扩增，结果显示选取529 bp基因为靶基因扩增弓形虫灵敏度与特异性均高于B1基因。因此本试验以弓形虫529 bp基因为模板进行LAMP引物设计，目的是使建立的LAMP检测方法更具代表性。与Du等[20]基于弓形虫529 bp基因片段为模板建立的LAMP检测方法(检测限为5 copies/μL弓形虫速殖子)相比，本研究通过摸索优化LAMP引物建立的荧光LAMP检测方法灵敏度更优且无需凝胶电泳，具有快速、无污染、灵敏度更高的优势。

本研究建立的弓形虫LAMP荧光检测方法灵敏度为1 copies/μL，高于行业标准规定的灵敏度(100 copies/μL)与市售的实时荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度(10 copies/μL)。与近年来国内建立的弓形虫LAMP检测方法灵敏度比较，朱志伟[20]在2021年建立的弓形虫LAMP荧光检测方法的灵敏度为10 copies/μL。王萌[21]建立的弓形虫LAMP诊断方法采用琼脂糖凝胶电泳扩增法可检测到10 copies/μL。因此，本研究建立的检测方法灵敏度在国内处于领先水平。同时，本研究建立的检测方法在50 min内即可完成，时间快于某市售实时荧光定量PCR检测试剂盒(75 min)。

本研究在反应体系中加入SYTO9荧光染料，目的是使仪器设备的适配性更加多样化，试验表明，建立的LAMP荧光反应体系既可在专用仪器MA-1610型等温荧光PCR仪上进行扩增并读取结果，也可通过设置实验室荧光定量PCR仪等设备参数进行等温扩增，且两种设备均无需开盖即可判读结果，大大降低了因琼脂糖凝胶电泳产生的气溶胶污染。

总之，本研究建立的弓形虫LAMP荧光检测方法在62 ℃ 50 min内对弓形虫的检测灵敏度为1 copies/μL，灵敏度高于行业标准(NY-T 573—2022)与某市售的荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度，与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体均无交叉反应，检测时间快，仪器适配性高，便于在基层动物医院及兽医实验室推广应用。