低共熔溶剂提取澳洲坚果青皮多酚工艺优化研究

黄宝玲，陈海彬，李咏梅，唐泳钰，李佳纯，叶婉苑

（广东科贸职业学院，广东广州 510430）

澳洲坚果又名夏威夷果、澳洲核桃等，因味美营养高，被誉为“坚果之王”[1]；其果实由果仁、果壳和青皮组成，可食用部位果仁在澳洲坚果占比17%，被广泛应用于即食型干果产品、澳洲坚果油、澳洲坚果乳饮料等[2]。青皮是坚果加工的主要副产物，占澳洲坚果鲜果质量的45%～60%，除极少量用于沤肥或饲料，绝大部分被丢弃，造成了极大的浪费。近年来，有较多学者意识到澳洲坚果青皮的潜在的保健、药用价值，已开展部分研究工作。郭刚军等人[3]采用80%乙醇超声提取澳洲坚果青皮，并用不同极性溶剂对其提取物进行分步萃取。结果表明，乙酸乙酯提取物含有较高含量的总酚和黄酮，正丁醇提取物提取多糖效果较好。张明等人[4]同样以乙醇为提取溶剂，通过超声辅助方式对澳洲坚果青皮的总酚提取进行工艺优化。结果表明，当乙醇体积分数为30%，料液比为1∶50（g∶mL），超声温度70 ℃，超声功率250 W，超声时间24 min 时，总酚提取效果最佳，可达（1 836.21±32.51） mg/100 g，该结果为澳洲坚果青皮生物活性成分的开发利用奠定了基础。

提取多酚的传统方法常以有机溶剂为介质，存在费时、生产能耗高、活性组分易损失、得率低等不足。近年来，环境友好的低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DESs） 备受关注[5]。DESs 是由氢键供体和氢键受体组成的2 个组分或3 组分低共熔混合物，具有熔点低、无毒、成本低、生物可降解性等良好特性[6]。通过改变DESs 的组成成分、摩尔比、水分添加量等因素，可使DESs 的理化性质发生变化，从而影响其对生物活性成分的提取。目前，已有较多研究表明低共熔溶剂法在植物活性成分提取中具有卓越的提取能力。孙悦等人[7]采用超声辅助低共熔溶剂法探究DESs 体系（组成组分、摩尔比、水分添加量） 与提取方式（料液比、提取温度、超声时间及超声功率） 对甘草多糖提取率的影响。结果显示，甘草多糖提取剂选择摩尔比1∶3，水分添加量40%的氯化胆碱- 异丙醇体系时，多糖提取率较好。并且在该提取溶剂下，改变提取方式优化甘草多糖提取工艺后，提取率可达8.31%。李杰等人[8]以氯化胆碱- 乙二醇- 水组成的低共熔溶剂（DESs）为提取溶剂，采用单因素试验和Box-behnken 响应面法对超声辅助DESs 提取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷进行了优化。结果表明，优化后的工艺对3 种黄酮类成分的总提取率为20.78%。王晓艺等人[9]同样采用超声辅助低共熔溶剂方法对玫瑰多酚进行提取工艺优化，通过与传统乙醇提取溶剂相比发现，低共熔溶剂具有较强的多酚提取能力，提取量较乙醇相比提高了24%。

为了解低共熔溶剂对澳洲坚果青皮多酚提取的规律，采用澳洲坚果青皮为试验材料，分别选择价廉易得、生物活性成分提取能力较好的氯化胆碱、1.3- 丁二醇为氢键供体与氢键受体，组成氯化胆碱- 1.3 丁二醇体系，创新性地通过超声辅助低共熔溶剂法提取澳洲坚果青皮中的多酚，优化出绿色环保高效的提取方式，为澳洲坚果青皮资源化利用提供有价值的参考依据，促进澳洲坚果产业可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验试剂与仪器

澳洲坚果青皮、氯化胆碱、乳酸、没食子酸标准品、福林酚、碳酸钠、无水乙醇。

UC-9000 型超声波清洗仪，深圳朗杰超声电器有限公司产品；UV3000 型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；FA124 型万分电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；TG16-WS 型离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 青皮多酚提取

青皮多酚提取流程：澳洲坚果青皮粉末→加入低共熔溶剂搅拌→混匀→超声辅助提取→离心→上清液。

1.2.2 低共熔溶剂配制

称量一定量的氯化胆碱与1.3 - 丁二醇，按照摩尔比1∶3 比例混合，置于80 ℃水浴中溶解，配制成100%的低共熔溶剂，冷却待用。

1.2.3 单因素试验设计

（1） DESs 体积分数对青皮多酚提取的影响。准确称取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 锥形瓶中，分别加入体积分数为0，12.5%，25%，50%，75%，100%的DESs 30 mL，用玻璃棒轻轻搅拌，在40 ℃条件下，用40 kHz 超声辅助提取30 min，将得到的粗提液以转速8 000 r/min 离心10 min，上清液待用。平行3 次试验。

（2） 料液比对青皮多酚提取的影响。准确称取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 锥形瓶中，分别加入体积分数为50%的DESs，配制料液比为1∶20，1∶60，1∶100，1∶140，1∶180，1∶220，用玻璃棒轻轻搅拌，在40 ℃条件下，用40 kHz 超声辅助提取30 min，将得到的粗提液以转速8 000 r/min 离心10 min，上清液待用。平行3 次试验。

（3） 提取时间对青皮多酚提取的影响。准确称取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 锥形瓶中，分别加入体积分数为50%的DESs 30 mL，用玻璃棒轻轻搅拌，在40 ℃、40 kHz 超声辅助条件下，分别提取10，30，50，70，90 min，将得到的粗提液以转速8 000 r/min 离心10 min，上清液待用。平行3 次试验。

1.2.4 没食子酸标曲的绘制

参照Pantelidis G E 等人[10]的方法测定没食子酸的标准曲线。准确称取一定质量没食子酸标准品，用无水乙醇配置10，20，40，60，80 μg/mL 的没食子酸标准溶液。分别吸取1 mL 不同质量浓度的没食子酸标准溶液，加入去离子水1 mL 和体积分数为10%的福林酚试剂5 mL，摇匀，静置反应5 min，加入质量分数为7.5%的碳酸钠溶液2 mL，用去离子水定容至10 mL，在避光条件静置1 h，以水为参比，测定反应液在波长765 nm 下的吸光度（A）。以没食子酸标准溶液质量浓度（C） 为横坐标，吸光度（A） 为纵坐标，做出没食子酸标准曲线。

1.2.5 青皮多酚提取量测定

用待测的青皮多酚上清液代替没食子酸标准溶液，测定吸光度，再代入标准曲线中，按照公式计算多酚提取量。

式中：C——上清液中多酚质量浓度，μg/mL；

V——上清液的体积，mL；

N——容量瓶量程，mL；

W——青皮粉末的质量，g；

M——提取液取液量，mL。

1.2.6 正交试验

在单因素试验的基础上，分别对DESs 体积分数、料液比、提取时间3 个因素取三水平设计因素水平表，进行L9（33）正交试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.2.7 数据处理与分析

试验数据与表格采用Excel 软件进行统计分析，试验图绘制采用Gragh Pad 软件。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的建立

以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到的没食子酸标准曲线的回归方程Y=0.012 5X+0.114 2，R2=0.999。由图1 可知，没食子酸质量浓度为0～100 μg/mL 与吸光度线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线

没食子酸标准曲线见图1。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 DESs 体积分数对青皮多酚提取的影响

DESs 体积分数对多酚提取量的影响见图2。

图2 DESs 体积分数对多酚提取量的影响

由图2 可知，青皮多酚提取量随着DESs 的体积分数呈现先增加后降低的趋势。当DESs 的体积分数为0～50%时，多酚提取量随着DESs 的体积分数增加而增加；当DESs 的体积分数为50～100%时，多酚提取量随着DESs 的体积分数增加而降低。主要的原因是：①DESs 可在常温下形成广泛的氢键网络，使其具有高黏度的特征，体积分数较高时，DESs 黏度过大时限制有效成分的提取；②DESs 中加入一定量水后，离子水之间形成的氢键可降低DESs 的黏度，提高从固体到液体的传质速率。另外，多酚类物质是带有多个羟基的极性物质，水的加入可增加DESs 的极性，使DESs 的极性趋近于青皮多酚极性，促进多酚类物质的溶解。但DESs 体积分数过小时，水量添加过多可能破坏体系中的氢键，影响多酚类物质与DESs 的氢键作用，从而造成多酚类物质提取量降低。综合考虑，DESs 的体积分数宜为50%，此时多酚提取量最高，为287.16 mg/100 g。

2.2.2 料液比对青皮多酚提取的影响

料液比对多酚提取量的影响见图3。

图3 料液比对多酚提取量的影响

多酚类物质提取过程中，物料与溶剂的比例对提取量有很大影响。由图3 可知，当青皮粉与DESs料液比小于1∶140 时，多酚提取量随着料液比的增大而提高。可能是因为随着DESs 添加量增多，青皮粉与DESs 之间的接触面积增大的同时，增大了两者之间的浓度差，增强青皮多酚类物质向DESs 扩散的传质推动力，提高提取率。当青皮粉与DESs 料液比为1∶140 时，多酚提取量达到最大。当料液比大于1∶140，DESs 趋于饱和时，多酚提取量随着料液比的增大而降低，可能是因为当料液比过大时，多糖、果胶、可溶性蛋白等物质的溶出影响了多酚类物质的溶解，使多酚提取量降低。综合考虑，选择1∶140 为最佳料液比。

2.2.3 提取时间对青皮多酚提取的影响

提取时间对多酚提取量的影响见图4。

由图4 可知，在10～50 min 内，随着提取时间的延长，青皮中多酚提取量呈增长态势。50 min 后，多酚提取量略有变化，但差异不明显。因为超声的空化作用能够使青皮粉中的细胞发生破裂，释放出多酚类物质。在初始阶段，提取时间较短，多酚提取不完全，提取量低；延长提取时间能够增加DESs与青皮粉之间的传质，提取量增加；50 min 后，提取过程接近于固液平衡，扩散速度降低，多酚提取量没有显著性增加。同时，超声过长可能会破坏多酚物质，提取时间为90 min 时多酚类物质略有下降。综合考虑，选择50 min 为最佳提取时间。

2.3 正交试验结果与分析

正交试验结果见表2，正交试验方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

以多酚提取量为考查指标，对提取工艺进行优选。由表2 可知，各因素对多酚提取效果的影响主次为料液比（A） ＞提取时间（C） ＞体积分数（B）。由表3 可知，料液比对青皮多酚提取量影响显著（p＜0.05）。数据显示，超声辅助低共熔溶剂提取青皮多酚最优工艺条件为A3B1C3，即料液比1∶160，体积分数40%，提取时间60 min。

3 结论

采用超声辅助低共熔溶剂提取澳洲坚果青皮中多酚类物质。在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的正交试验方法优化青皮多酚的最佳提取工艺。试验得到最优提取工艺参数为料液比为1∶140，低共熔溶剂体积分数40%，超声提取时间60 min，此条件下多酚得率为439.64 mg/g，提取量优于前人报道结果，说明低共熔溶剂具有良好的多酚提取能力。

不仅为澳洲坚果加工产业处理青皮等副产物资源化、高值化的综合利用提供了数据支撑，也为多酚、黄酮等生物活性成分提供了一种高效绿色环保的提取方法，在功能性食品领域上具有广阔的应用前景。