基于CSE/H2S体系探讨葱白提取物对H2S催化酶及趋化因子CX3CL1的作用机制

雷 杰, 郑琼莉, 段刚峰

(1湖北中医药大学中医临床学院, 武汉 430000; 2博乐市人民医院, 新疆 博乐 833400)

据《中国心血管健康与疾病报告2019》提供的数据显示[1],心血管疾病依然占城乡居民总死亡原因的首位,包括肿瘤和其他疾病在内。其中冠心病的患病率及死亡率自2012年以来一直呈逐年上升趋势,15岁及以上人口冠心病患病率为10.2‰,造成了沉重的社会负担。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是导致冠心病的重要病理学基础,其特征是大、中型血管管壁脂质沉积、内膜增厚、斑块形成。动脉粥样硬化的形成与发展过程十分复杂,目前尚未完全阐明,主要涉及脂质代谢、炎症、氧化应激、免疫等多个方面。近年来,硫化氢(H2S)气体信号分子以其抗氧化应激[2]、抗炎症[3-4]等效应,在调控动脉粥样硬化发生发展方面起着重要作用。H2S主要由胱硫醚β合成酶(Cystathionine β synthase,CBS)、胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine γ lyase,CSE)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST)催化生成。在心血管系统中,H2S在调节血脂含量、抑制泡沫细胞形成、降低基质金属蛋白酶(MMP)活性、促进内皮细胞增殖和迁移、抑制趋化因子受体CX3CR1和趋化因子配体CX3CL1的表达、抗凝血等方面发挥了重要的作用[5]。而CX3CR1和CX3CL1在AS发展过程中可趋化单核细胞黏附到活化的内皮细胞,激活血小板[6]。本团队前期研究证实,与空白模型组对比,葱白提取物可以显著升高急性心肌缺血大鼠血浆H2S、一氧化氮(NO)水平(P<0.01)[7],还可通过PPAR信号通路降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的浓度,减少血管壁脂质沉积[8]。本研究拟进一步探讨葱白提取物能否通过调控内源性H2S水平,抑制CX3CR1、CX3CL1表达,降低MMP活性,从而改善动脉粥样硬化病变,为动脉粥样硬化的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物纯种健康雄性SD大鼠,SPF级,体重(200±20)g,共40只,由湖北省实验动物研究中心提供(动物合格证编号:42000600000069)。饲养于武汉市中西医结合医院中心实验室,每笼5只,动物房昼夜12 h光暗变替,室内温度25℃,湿度60%,饲料与饮水均经辐射消毒并可自行随意摄取。本研究通过武汉市第一医院医学伦理委员会审批(审批号:[2018]8号)。

1.2 实验试剂葱白提取物由武汉市中西医结合医院制剂中心提供(批号:20170326),配置成最终浓度为0.10 mg/mL的溶液。该提取物是将双子叶百合科植物分葱的新鲜鳞茎先经微波干燥,再行超临界萃取而得,总得率为1.85%左右,其主要成分包括硫化合物、甾体、皂苷、不饱和脂肪酸等。辛伐他汀(舒降之)片由杭州默沙东制药有限公司提供(批号:02001697),配置成最终浓度为10 mg/mL的溶液。胆固醇、胆酸钠、维生素D3粉剂和丙基硫氧嘧啶均购自武汉宇阳锋锐生物科技有限公司(批号分别为:C104028,B13101001,C105354),其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器低温高速离心机(Sorvall Stratos,赛默飞,美国),超低温冰箱(MDF-390AT,SANYO,日本),组织包埋机(Leica 公司,德国),组织切片机(Leica 公司,德国),荧光显微镜(CX22,OLYMPUS公司,日本),全自动生化分析仪(AU2700,贝克曼公司,美国),多功能酶标仪(SpectraMax iD5,美谷分子仪器有限公司,美国),垂直电泳仪(JY-SCZ,北京六一仪器厂),凝胶图像分析仪(EBOX CX5,Viber Lourmat 公司,法国)。

1.4 方法

1.4.1 模型制备及分组 40只大鼠适应性喂养1周,随机选择10只作为正常组,另外30只参考文献[9]的方法制备大鼠AS模型,再随机分为模型组、葱白提取物组、辛伐他汀组,每组各10只。其中正常组以基础饲料喂养,模型组、葱白提取物组、辛伐他汀组均以高脂维生素D3饲料(2%胆固醇、0.5%胆酸钠、3%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.012 5%维生素D3粉剂和85.275%的基础饲料)喂养。各组饮水为经辐射消毒的普通自来水。在实验开始时,即用维生素D3针剂(3×105u/kg体质量)在大鼠右下肢行肌肉注射1次,每周1次,连续4周。

1.4.2 给药方法 从第5周开始,葱白提取物组大鼠给予配置好的葱白提取物溶液10 mL/kg体质量灌胃,辛伐他汀组大鼠给予辛伐他汀混悬液10 mL/kg体质量灌胃;正常组和模型组均给予等容积生理盐水10 mL/kg体质量灌胃,共连续8周。

1.4.3 标本取材与制备 在第12周时,将各组大鼠禁食过夜,每组大鼠均予以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉并固定,先从腹主动脉抽血,分离血浆、血清,于-80℃保存,然后插管入升主动脉,用生理盐水冲洗,分离主动脉。每组取部分主动脉组织于-80℃保存备用(用以RT-PCR和WB检测),部分大鼠主动脉组织以1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液灌洗,取下整段主动脉备用,用以HE染色。

1.4.4 血脂水平检测 用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)的含量。

1.4.5 血管病变程度检测 将固定好的主动脉标本脱蜡至水,依次予以苏木素、伊红染液染色,然后脱水封片,观察血管病理损伤程度。

1.4.6 H2S催化酶含量的检测 采用Western blot法检测大鼠主动脉胱硫醚β合成酶(CBS)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3MST)的含量。

1.4.7 主动脉组织趋化因子及MMP基因及蛋白表达的检测 采用RT-PCR和Western blot方法检测CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9的基因及蛋白表达。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂水平比较与正常组比较,模型组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B浓度均升高(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇浓度降低(P<0.05),提示造模成功。与模型组比较,葱白提取物组及辛伐他汀组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B浓度均降低(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇浓度升高(P<0.05),说明葱白提取物同辛伐他汀一样,都能有效调节大鼠血清血脂水平,见表1。

表1 葱白提取物对各组大鼠血脂水平的影响

2.2 病理组织学检测正常组大鼠主动脉内膜光滑,结构完整,局部无断裂及缺损,内膜无增厚,管壁无可见斑块,管腔无狭窄。模型组内膜结构局部断裂不连续,部分内膜明显增厚,在内膜局部还可看到大量脂类物质进入内膜下形成的胆固醇结晶及较大斑块,斑块纤维帽较薄,管腔可见明显狭窄。葱白提取物组及辛伐他汀组内膜亦可观察到增厚及局部结构破坏,并可在内膜局部观察到脂类物质沉积形成的粥样斑块。与模型组比较,葱白提取物组及辛伐他汀组斑块内部的胆固醇结晶较少,管腔狭窄程度较轻,见图1。

正常组 模型组 葱白提取物组 辛伐他汀组

2.3 葱白提取物对各组AS大鼠主动脉CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9基因mRNA表达水平的影响与正常组比较,模型组CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表达均上调。与模型组比较,葱白提取物组和辛伐他汀组CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表达均下调,见表2。

表2 葱白提取物对AS大鼠主动脉组织CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9基因mRNA表达的影响

2.4 葱白提取物对大鼠主动脉CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1蛋白表达的影响与正常组比较,模型组大鼠主动脉组织中3MST、CBS蛋白相对表达量降低(P<0.05),而CX3CL1、CX3CR1蛋白相对表达量升高(P<0.05)。与模型组比较,葱白提取物组和辛伐他汀组大鼠主动脉组织中3MST、CBS蛋白相对表达量升高(P<0.05),而CX3CL1、CX3CR1蛋白相对表达量降低(P<0.05)。葱白提取物组与辛伐他汀组间比较,差异无统计学意义,见表3、图2。

图2 各组大鼠CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1、GADPH蛋白表达水平

表3 葱白提取物对大鼠主动脉CBS、3MST、CX3CL1、CX3CR1表达的比较

3 讨论

动脉粥样硬化在中医学中并无与之相对应的病名,以其脂质沉着,痹阻血脉的特点,大致可归于“胸痹”病范畴。“胸痹”的病因病机在《金匮要略》中被概括为:“阳微阴弦”,意为阳气上虚,阴寒下盛,寒乘虚而往上攻,所以胸痹心痛。根据这一特点,在治疗上《金匮要略论著》提出“阳无取乎补,宣而通之”,可见“辛温通阳”是治疗胸痹病的重点所在。葱属百合科植物,葱白为其近根部的鳞茎,味辛性温,具有发汗解表、通达阳气的功效[10]。现代药理学研究亦发现[11],葱白提取物有调节血脂代谢、抗氧化损伤、抗炎症反应、抗血小板聚集、促进血管损伤后内皮化等作用。

趋化因子CX3CL1最早由Bazan等[12]发现,它是一种具有可溶型和膜结合型双重形式的异常趋化因子,可溶型主要起趋化因子的作用,膜结合型主要介导黏附作用。在动脉粥样硬化过程中,表达CX3CR1的血液单核细胞与表达CX3CL1的血管内皮细胞结合,促进单核细胞和内皮细胞之间的黏附。CX3CL1或CX3CR1基因缺失均可使小鼠产生抗动脉粥样硬化作用。MMP分为I型胶原酶、明胶酶、基质降解酶、膜型基质金属蛋白酶、其他基质金属蛋白酶五大类,能降解细胞外基质,引起炎症反应、调控炎症相关因子,参与动脉粥样硬化全过程[13]。其中,MMP9主要对IV型胶原进行降解,进而损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞迁移和增殖、加剧管壁局部炎症反应、引发斑块破裂和血栓形成。MMP7定位于AS斑块易破裂处,但在正常血管中不易监测到。有研究报道称,MMP7参与N-钙黏蛋白的分解,调节血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)的凋亡,使AS斑块纤维帽变薄,使得斑块不稳定,易于破裂[14]。本实验研究发现,与模型组相比,葱白提取物组CX3CL1、CX3CR1蛋白相对表达量显著下降(P<0.05),CX3CL1 mRNA、CX3CR1 mRNA、MMP7 mRNA、MMP9 mRNA表达均下调。说明葱白提取物通过抑制CX3CL1、CX3CR1、MMP7、MMP9的表达,发挥抗动脉粥样硬化作用。

自1989年Warenycia等[15]在人脑中首次发现H2S以来,科学家们对这个新型气体分子展开了广泛研究。不仅证实内源性H2S具有抗动脉粥样硬化作用[16],更有研究发现[17],H2S抑制了活化巨噬细胞中CX3CR1的表达,降低了apoE-/-小鼠主动脉中CX3CR1的表达,且H2S诱导CX3CR1表达的降低是通过过氧化物酶体增殖激活物受体c途径介导的。支持这一观点的证据是,外源性H2S供体硫氢化钠(NaHS)剂量依赖性地增加了干扰素c(IFN-c)或炎症递质脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中PPAR-c的DNA结合活性。CSE过表达也增强IFN-c或LPS刺激RAW264.7细胞中PPAR-c的激活。本研究亦证实,与模型组相比,葱白提取物组大鼠主动脉组织中生成H2S的催化酶—CBS、3MST蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。

综上所述,葱白提取物可能通过调控内源性H2S生成体系,抑制CX3CL1、CX3CR1表达、降低MMP7、MMP9活性,从而起到抗AS的功效。然而本实验数据仍然不足以建立H2S抑制动脉粥样硬化作用与巨噬细胞CX3CR1-CX3CL1表达之间的明确因果关系,进一步的研究可能需要在CX3CR1/CX3CL1基因修饰的大鼠中进行,以探测确切的相关连锁反应。