艾灸对膝骨关节炎兔软骨Wnt 信号通路及血清炎性因子的影响

张宪基 汪宗保 王科文 李 鑫 李德坤 单自亮 姚长风

（安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽合肥 230038）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种在中老年人群中常见的退行性关节疾病，主要临床表现为膝关节的疼痛、肿胀、僵硬、活动受限等[1]。流行病学研究显示，全球约有6.5亿人受到KOA的影响，其中年龄在40岁以上者约占22.9%[2]。KOA引起的膝关节不稳定对患者的日常生活造成了极大不便。因此，探索科学、有效、多样的KOA治疗方案并研究其具体作用机制显得尤为重要。

临床研究表明，艾灸可有效降低KOA患者体内炎性因子水平并改善患者的临床症状与膝关节功能状况[3]。有实验显示，不同产地和存储期限灸材均可有效降低KOA模型大鼠膝关节肿胀程度、软骨组织细胞病变程度和曼金（Mankin's）评分[4]。明代《针灸大成》记载：“犊鼻，主膝中痛不仁”，一项对近20年临床针灸治疗KOA文献的复杂网络分析也发现，犊鼻是临床治疗KOA选穴中最核心的腧穴[5]。目前研究发现，影响KOA发生和发展的信号通路有十余条，其中Wnt信号通路是与炎性反应相关的信号通路之一[6]。Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路在骨骼、软骨及滑膜组织中起着直接调节作用，在软骨细胞的不同生长阶段均发挥重要调控作用[7]。研究发现，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，能够促进软骨细胞增殖并抑制其细胞凋亡[8]。本研究制作KOA兔模型，并予艾灸犊鼻穴干预，观察其干预效果，并从Wnt/β-catenin信号通路角度探讨艾灸犊鼻穴治疗KOA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性普通级新西兰兔24只，3月龄，体质量2.2～2.5 kg，购自邳州市东方养殖有限公司，合格证号：SCXK苏20170002。兔分笼饲养，室温24℃，饮食自由。本实验中对动物的处理均符合国家科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，且经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（AHUCM-rabbits-2022056）。

1.2 主要试剂 木瓜蛋白酶（批号：517S021，北京索莱宝科技有限公司）；白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒（批号：GR20220119，武汉基因美生物科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（批号：GR20220426，武汉基因美生物科技有限公司）；总RNA提取试剂盒（批号：3505080，美国生命技术公司）；荧光染料（批号：05229413，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司）；反转录试剂盒（批号：AL21115A，北京宝日医生物技术有限公司）；RIPA细胞裂解液（批号：09271919023，上海碧云天生物技术有限公司）；PAGE胶促凝剂（批号：1020F024，北京索莱宝科技有限公司）；PBS缓冲液粉末（批号：19022401，北京中杉金桥生物技术有限公司）；PVDF膜（批号：R7SA9081E，美国密理博公司）；山羊抗兔IgG（批号：20270051，北京中杉金桥生物技术有限公司）；苏木素染液（批号：09232110，安徽欣乐生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器 JW3021HR离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱（上海三发科学仪器有限公司）；YB-7LF生物组织包埋机（湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司）；PIKOREAL 96荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司）；EPS300电泳仪（上海天能科技有限公司）；VE-180电泳槽（上海天能科技有限公司）；VE-186转膜仪（上海天能科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 24只兔随机分为正常组、模型组、艾灸组，每组8只。采用木瓜蛋白酶水溶液膝关节腔注射的方式制作KOA模型，于实验开始的第1、4、7天向模型组和艾灸组兔右膝关节腔内注射2%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL，并于首次药物注射后第14天对造模兔右膝关节进行膝骨性关节病病情程度指数（Lequesne MG）评级，总分大于4分即为造模成功[9]。模型组、艾灸组所有兔均造模成功。

2.2 干预方法 造模成功后，即首次药物注射后第15天开始，艾灸组悬灸兔右膝“犊鼻”穴，穴位定位参照《实验针灸学》[10]，艾条距兔皮肤约3～5 cm，20 min/次，每日1次，连续艾灸21 d。空白组、模型组正常饲养，不作其他任何处理。

2.3 样本采集 干预结束后次日，各组兔麻醉，心脏采血取动脉血5 mL，静置，离心分离血清，-80 ℃冰箱保存备用于酶联免疫吸附（ELISA）试验。取各组兔右膝关节股骨端软骨，经固定、脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片等操作后备用于苏木精-伊红（HE）染色、免疫组化染色使用。取各组兔右膝关节胫骨平台软组织，置于液氮中，转入-80℃超低温保存以备用于实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Real-time PCR，qPCR）法、蛋白免疫印迹（Western blot）法检测使用。

2.4 指标检测

2.4.1 ELISA法 测 定 兔 血 清 中IL-1β、TNF-α含量 取-80℃保存备用的各组兔血清，按照ELISA试剂盒检测说明书，在样品孔和标准孔分别加入血清和标准品各50 µL，于各孔再加入50 µL酶标记抗体，封好后放置于37℃恒温箱中反应30 min；反应结束后，充分弃尽液体，洗涤液清洗，并扣干；在各孔中加入显色试剂，37℃避光反应10 min；各孔加入终止液50 µL，终止显色；使用酶标仪450 nm波长测定各孔的吸光度值，绘制标准品线性回归曲线，计算各组兔血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.4.2 HE染色法观察兔膝关节软骨病理形态 取各组兔右膝关节软骨组织石蜡切片，置入干燥箱66 ℃烤片20～30 min，常规脱蜡复水，苏木素染液染色2～5 min，1%盐酸酒精分化，饱和碳酸锂溶液蓝化，95%乙醇脱水2 min，伊红染液染色，常规脱水透明，树胶封片，显微镜观察结果。

2.4.3 qPCR法检测兔软骨组织中Wnt信号蛋白-3α（Wnt3α）、β-catenin、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表达 取-80 ℃冻存的各组兔膝关节软骨组织，采用Trizol法提取软骨组织的总RNA，逆转录得到cDNA。用RT-PCR进行PCR反应，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参基因，引物序列见表1。2-△△Ct计算各指标mRNA的相对表达量，△△Ct=（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参）。

表1 引物序列

2.4.4 Western blot法检测兔软骨组织中Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白表达取-80 ℃冻 存的各组兔膝关节软骨组织，加入RIPA裂解液裂解，12 000×g离心15 min，收集上清液；配制凝胶，上样，电泳，转膜至PVDF膜，室温封闭2 h；加一抗，4℃孵育过夜，洗涤液（PBST）洗涤；加二抗，室温孵育1.2 h，洗涤液洗涤；通过ECL发光试剂盒检测蛋白，使用Image J软件进行胶片条带分析，计算相对表达量。

2.4.5 免疫组化法检测兔软骨组织中IL-1β、TNF-α的表达 取各组兔膝关节软骨组织石蜡切片置入干燥箱，66 ℃烤片20～30 min，常规脱蜡至水，抗原修复，缓冲液封闭；加一抗，37 ℃孵育60 min，PBS-T冲洗；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS-T冲洗；DAB显色，复染，脱水透明，封片，显微镜下采集数据及图片。用IPP 6.0软件分析样本中TNF-α、IL-1β的积分光密度（integral optical density，IOD）值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。本研究所有数据均符合正态分布，以均值±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组兔血清IL-1β、TNF-α水平比较 模型组兔血清IL-1β、TNF-α水平显著高于正常组（P＜0.05），艾灸组兔血清IL-1β、TNF-α水平明显低于模型组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组兔血清IL-1β、TNF-α水平比较（x-±s） 单位：pg/mL

3.2 各组兔膝关节软骨组织病理形态比较 HE染色结果显示，正常组兔膝关节软骨表面光滑平整，软骨结构清晰，软骨细胞数目多、形态自然且分布均匀，基质染色均匀，细胞排列整齐，潮线识别度清晰，软骨内未见血管、神经及纤维增生。模型组兔膝关节软骨表面粗糙不平，软骨结构紊乱，软骨细胞数目少且分布紊乱、形态异常，潮线不可见。艾灸组兔膝关节软骨表面局部表现粗糙，软骨结构较为完整，软骨细胞数目较多且分布较均匀、形态较为正常，潮线模糊可见。见图1。

3.3 各组兔膝关节软骨组织中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相对表达量比较 模型组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相对表达量均显著高于正常组（P＜0.05），艾灸组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相对表达量均显著低于模型组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组兔膝关节软骨组织中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相对表达量比较（x-±s）

3.4 各组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量比较 模型组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量显著高于正常组（P＜0.05）；艾灸组兔膝关节软骨组织上述蛋白相对表达量显著低于模型组（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 各组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白电泳图

表4 各组兔膝关节软骨组织Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量比较（x-±s）

3.5 各组兔膝关节软骨组织IL-1β、TNF-α蛋白表达比较 免疫组化结果显示，正常组兔膝关节软骨表面完整，软骨组织中几乎未见棕色颗粒，即IL-1β、TNF-α蛋白呈弱阳性表达。模型组兔膝关节软骨表面粗糙，棕色颗粒较多，即IL-1β、TNF-α蛋白呈强阳性表达。艾灸组兔膝关节软骨表面较平滑，棕色颗粒相对较少，即IL-1β、TNF-α蛋白呈中等阳性表达。见图3、图4。

图3 各组兔膝关节软骨组织IL-1β免疫组化表达（×200）

图4 各组兔膝关节软骨组织TNF-α免疫组化表达（×200）

各组兔膝关节软骨组织TNF-α、IL-1β蛋白表达IOD值统计结果显示：模型组兔膝关节软骨组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著高于正常组（P＜0.05），艾灸组兔膝关节软骨组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著低于模型组（P＜0.05）。见表5。

表5 各组兔膝关节软骨组织IL-1β、TNF-α蛋白表达（IOD值）比较（x-±s）

4 讨论

骨科临床的常见疾病KOA主要由外伤、肥胖和慢性劳损等因素引起，其病理生理表现主要体现在关节软骨的退行性改变和继发性的骨质疏松[6]。随着人口老龄化现象不断加剧以及KOA发病呈年轻化趋势，KOA的发病率逐年上升[1]。目前，KOA主要采用药物治疗，并辅以膝关节锻炼，以提升患肢肌力与膝关节活动度，改善膝关节的稳定性[11]。但是，非甾体类抗炎药和止痛药等易导致胃肠道不良反应，导致患者依从性差[12]。因此，寻找科学有效治疗KOA的方法变得十分迫切。

KOA可归属于中医学“痹证”范畴，《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，可见痹证与风寒湿三邪密切相关。艾灸是一种将艾绒点燃后置于腧穴或特定部位，利用其燃烧后所产生的挥发物和热量透过皮肤组织，通过经络传入机体，作用于机体的过程，可温经通络、活血通痹，不仅安全性高、价格低廉，还具有操作简便、副作用少等优点，故艾灸也被广泛应用于KOA的治疗之中。研究表明，艾绒燃烧时具有热辐射和远红外辐射效应，可改善血液循环并通过红外辐射共振作用使异常细胞产生共振，从而活化组织细胞，改善组织代谢环境[13]。本研究选用的犊鼻穴归属多气多血的足阳明胃经，位于髌韧带外侧凹陷中，具有祛风散寒、通经活络、消肿止痛的作用。膝关节处皮肤薄，皮下组织少，股动脉、腘动脉、胫前动脉、股深动脉等分支在此处构成动脉网，为膝关节周围组织提供丰富的血供。艾灸通过上述两个效应可促进膝关节动脉网功能的恢复，从而改善周围组织代谢平衡，延缓软骨破坏和KOA进展。

研究证实，关节软骨是没有血管和神经的结缔组织，由软骨细胞和细胞外基质（ECM）组成[14]，其中ECM的主要成分为Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白多糖。KOA患者软骨退变的病理变化主要是由于膝关节软骨细胞的增殖与凋亡之间平衡失调、软骨基质过度降解等导致的[15]。TNF-α、IL-1β是常见且重要的炎性因子，共同参与了软骨细胞和软骨基质的破坏，均能诱导软骨细胞的早期凋亡[16]。两者在KOA患者的软骨中均存在过度表达的现象，且两者在KOA患者血清和关节滑液中含量均明显升高，其含量与病情严重程度呈正相关[16-18]。本研究结果显示，艾灸组兔血清及膝关节软骨中IL-1β、TNF-α表达均明显低于模型组，说明艾灸可缓解KOA兔的关节炎症反应。

在关节炎（osteoarthritis，OA）的发生发展过程中Wnt/β-catenin信号通路会异常激活，从而导致ECM降解和软骨细胞凋亡等发生[19]。Wnt信号激活后，会与其受体相结合并活化信号蛋白，从而抑制β-catenin的泛素化和降解，β-catenin分泌因此增加，Wnt进而与转录因子结合，从而激活基质金属蛋白酶（MMPs）等下游基因的表达，促使软骨破坏[20]。

β-catenin作为具有转运功能的Wnt信号通路下游因子，在软骨细胞的分化、增殖和凋亡中起着重要作用。研究证实，KOA患者关节液和血清中β-catenin表达水平升高，并与病情程度呈正相关[21]。而Wnt3α在OA的发展中也同样起着重要的作用，可作为监测OA病程的指标[22]。MMP-13则是MMPs家族中的一员，参与了软骨细胞、蛋白多糖、胶原蛋白的降解过程，ECM由此受到破坏且其正常合成被抑制，使关节软骨肿胀，抗外力能力下降，促使软骨退行性改变，阻止软骨修复，并推动OA的发生发展[23]。研究表明，在KOA患者关节液、血液和软骨中MMP-13表达量均异常升高，同时也表明关节液中MMPs的表达水平可作为间接判断患者软骨组织病变程度的指标之一[24]。本研究结果显示，艾灸组兔膝关节软骨组织Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表达均明显低于模型组，且软骨表面较平滑，软骨组织结构相对完整、清晰，软骨细胞数目相对较多，形态较正常且分布较均匀，提示艾灸可能通过对KOA兔膝关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路关键因子表达的抑制作用以延缓KOA兔软骨破坏进展。

综上，艾灸能够改善KOA兔膝关节软骨破坏，抑制血清及软骨中IL-1β、TNF-α等炎性因子的表达，下调软骨中Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表达，从而达到延缓KOA进展的目的，说明艾灸可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而发挥治疗KOA的作用。下一步拟通过检测关节液、滑膜中相关因子的表达以进一步探究艾灸改善KOA的机制研究。同时，艾灸具有热效应、辐射效应、挥发物效应等多效应的治疗特点，今后可进一步探讨艾灸在改善KOA中具体发挥效应及具体有效成分的占比，为研发出新型艾灸产品提供理论基础。