老年结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达变化和意义

李建升 郭林 迟春华 高善语 管仲安

(1山东中医药大学2023级博士研究生,山东 济南 250000;2山东中医药大学附属医院肛肠科)

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤,在我国发病率呈快速增长趋势,日常饮食不规律、生活作息不规律是引发结肠癌的主要原因之一〔1〕。老年人群结肠癌的发病率处于较高水平,应重视老年人群结肠癌的筛查〔2〕。临床研究显示,超过60%的结肠癌患者确诊时已处于晚期,而晚期结肠癌患者的5年生存率低于20%,老年结肠癌患者预后更差〔3〕。准确预测老年结肠癌患者的预后对治疗方案的合理制定具有重要的参考价值。染色体凝缩蛋白复合物I(NCAP)D2异常表达参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭过程〔4〕。Krüppel样因子(KLF)5是人体重要的转录调控因子,与细胞生长、凋亡密切相关〔5〕。跨膜受体蛋白Notch1是一种配体激活的转录因子,可通过激活下游靶基因来调控细胞增殖、转移等过程〔6〕。目前关于NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA在结肠癌中表达特点及意义的研究仍十分少见。本研究探究老年结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达变化和意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1～12月山东中医药大学附属医院收治的老年结肠癌患者85例。纳入标准:①符合美国国立综合癌症网络2017版结直肠癌高风险评估指南中的诊断标准,并经组织病理学检查确诊为原发性结肠癌;②无手术治疗禁忌证并行手术治疗,术前无放化疗等抗肿瘤相关辅助治疗史者;③能够正常交流,完成随访者。排除标准:①合并其他重要脏器严重器质性病变;②有结肠手术史;③合并肠道感染性疾病。平均年龄(68.31±4.53)岁;本研究经医院伦理委员会审核批准,患者自愿参与并签署知情同意书。

1.2主要试剂 Trizol总RNA抽提试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂均购自上海爱必信生物科技有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)总蛋白裂解液、蛋白含量检测试剂盒购自捷世康(青岛)生物科技有限公司;兔抗人NCAPD2单克隆抗体、鼠抗人KLF5单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、山羊抗鼠/山羊抗兔IgG均购自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3组织标本收集与处理 术中采集老年结肠癌患者的肿瘤组织和正常组织(距离肿瘤组织5 cm以上),立即转入液氮中冻存,-80 ℃超低温冰箱中保存待测。

1.4Western印迹检测组织标本中NCAPD2、KLF5蛋白表达 肿瘤组织和癌胚正常组织使用组织匀浆机在冰上进行组织匀浆,使用总蛋白RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法进行蛋白定量检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白(室温下电泳2 h,电压:120～150 V),转至聚偏氟乙烯膜,封闭2 h。滴加兔抗人NCAPD2单克隆抗体(稀释倍数1∶700)、鼠抗人KLF5单克隆抗体(稀释倍数1∶500)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释倍数1∶2 000),4 ℃过夜,次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,稀释倍数1∶4 000,增强化学发光法(ECL)显影,使用ImageJ软件读取各条带的灰度值。

1.5反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测组织标本中Notch1 mRNA表达 肿瘤组织和癌胚正常组织使用组织匀浆机在冰上进行组织匀浆,Trizol总RNA提取试剂盒提取总RNA,全波长分光光度仪检测浓度,逆转录为cDNA。Notch1 mRNA引物设计与合成由北京沫之东生物技术有限公司完成。Notch1 引物:上游5′-CAAGAACAGGAGAAAGTTTACCACAG-3′,下游5′-GTGGGTCCTCCCGGAGGTTAGCTAT-3′。β-actin引物:上游5′-GTTTTGTTACTAGGGCTGCTAGGCC-3′,下游5′-CAGGTGCTGGGTCAAGTCAATGCAA-3′。PCR体系30 μl,反应条件:95 ℃ 预变性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,共40个循环,95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s。反应结束后上仪器读取各样品管的CT值,相对定量法计算Notch1 mRNA表达水平。

1.6资料收集与随访 收集老年结肠癌患者的人口学特征和临床病理资料。以患者出院时日期为随访起点,进行3年随访,记录患者生存情况,分为预后良好组(生存),不良组(死亡),随访频率为每3个月1次,方式以院内复查为主、电话跟踪为辅。

1.7统计学分析 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验、受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.1不同组织中NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达比较 老年结肠癌患者结肠癌组织中NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平明显高于正常组织(均P<0.01)。见表1。

表1 不同组织中NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平比较

2.2不同临床病理类型的结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达比较 NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平在不同病理分期、分化程度、淋巴结转移情况、远端转移情况的结肠癌患者差异均有统计学意义(P<0.01);其中,浸润程度T3～T4、有淋巴结转移、有远端转移的结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平明显高于浸润程度T1～T2、无淋巴结转移、无远端转移的结肠癌患者(P<0.01);随着分化程度的降低,结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平逐渐升高(均P<0.01);NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平在不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径的结肠癌患者差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理类型的结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达比较

2.3不同预后水平的老年结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达比较 不良组老年结肠癌患者结肠癌组织中NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平明显高于预后良好组(均P<0.01)。见表3。

表3 不同预后水平的老年结肠癌患者NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达比较

2.4NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA对老年结肠癌患者预后的预测价值 NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA表达水平对老年结肠癌患者预后均具有较高的预测价值(P<0.01);其中各指标联合检测对老年结肠癌患者预后的预测价值最高,特异度、阳性预测值均明显高于各指标单独检测。见图1、表4。

图1 NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA对老年结肠癌患者预后预测价值的ROC曲线

表4 NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA对老年结肠癌患者预后的预测价值

3 讨 论

我国结肠癌的发病率和死亡率均处于较高水平,与人口老龄化、居民健康体检意识较弱、结肠癌发病早期症状不特异等因素有关〔7,8〕。随着分子生物学技术、肠镜等快速进步和在临床中的推广应用,明显提高了结肠癌的检出率,但多数患者确诊时已处于中晚期,准确预测患者的预后水平,对治疗方案的合理制定,延长患者生存时间具有重要的参考价值。目前外周血糖类抗原、癌胚抗原等肿瘤标志物已用于结肠癌患者的病情和预后评估,但受限于灵敏度和特异度不够理想,预测结肠癌预后的效果不佳〔9〕。NCAPD2是蛋白质编码基因,属于染色体凝缩蛋白复合物,在细胞有丝分裂等过程中发挥调控作用〔10〕。研究发现,NCAPD2可激活mTOR蛋白复合体1来加速细胞周期的转变,进而抑制细胞自噬,促进结肠癌细胞的生长、转移和侵袭〔11〕。KLF5属于KLF家族,是一个含有保守锌酯结构域的转录因子家族,通过与靶基因序列结合后调节转录活性〔12〕。人体中KLF家族包括17个成员,根据转录活性可分为3组,KLF5属于第2组成员,由激活靶基因转录的激活剂构成,在不同肿瘤中发挥不同作用。如KLF5能够促进乳腺癌发展与侵袭〔13〕;但在食管癌中表现为抑癌基因特点〔14〕。

多种基因参与结直肠癌的发生与进展过程,影响结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭等过程〔15〕。Notch1基因定位于人染色体9q34.3区,作为一个转录因子能够激活配体,其可将细胞外信号转化为细胞核中基因表达,具有细胞核转录调控和细胞表面受体调控的双重作用〔16〕。Notch1信号通路是细胞间信号传导的高保守途径,可调节人体细胞增殖、分化、凋亡及新生血管形成等过程;还能够激活mTOR、PI3K/AKT等信号通路来促进恶性肿瘤的发生与发展〔17〕。本研究结果提示,NCAPD2、KLF5蛋白及Notch1 mRNA在老年结肠癌患者中高表达,且与浸润程度、分化程度及淋巴结转移、远端转移情况密切相关,随着浸润程度增加、分化程度降低上述指标表达水平明显提升,存在淋巴结转移和远端转移的老年结肠癌患者上述指标表达水平明显提升。

全身化疗是老年结肠癌患者常用的治疗手段,5-氟尿嘧啶与细胞毒性药物联合治疗能够有效提高转移性结肠癌患者的生存时间,包括FOLFOX方案、XELOX方案、FOLFIRI方案等〔18〕。随着近年来靶向治疗技术的快速发展,上皮生长因子抑制剂、免疫检查点抑制剂的研发上市和推广应用,与全身化疗相互结合有助于进一步改善结肠癌患者预后,出现了更多的药物组合方案。因此准确预测老年结肠癌患者预后水平对治疗方案的综合制定具有重要意义。