代谢组学在食源性致病弧菌研究中的应用进展

赵燕妮,武若冰,余瑞,张森虎,李华,刘欢*

1(陕西科技大学 食品科学与工程学院,陕西 西安,710021) 2(南方科技大学,公共分析测试中心,广东 深圳,518055)

弧菌是海洋环境中丰富的致病菌之一,在世界各地的海水水域中均可见其身影。其生长迅速且拥有很强的适应能力,可在短时间内引起病害的大面积爆发,严重制约着我国水产养殖业和捕捞业的持续发展,甚至威胁人类生命健康。到目前为止,已超过100种弧菌被鉴定,其中创伤弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等是世界范围内引起人类食源性弧菌病的主要病原菌。由致病性弧菌引起的食源性疾病通常与食用生的或未煮熟的海鲜有关,食源性弧菌感染的常见症状包括急性肠胃炎、败血症等。同时,食源性弧菌病具有明显的季节性分布,一般在每年5～7月为发病高峰期。此外,随着全球气候变暖,发病率持续上升[1-3]。

抗生素是弧菌病害防治的主要手段,起初抗生素具有见效快、价格低廉等优势,然而滥用抗生素可能会导致细菌的耐药性,甚至会出现超级细菌。开发新型安全、高效的病害防治手段已成为当前亟待解决的问题。为了使弧菌病害防治手段的开发做到有的放矢,开展弧菌致病机制的基础研究工作就显得尤为重要。

多组学技术,即整合基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学等,可为细菌致病机制及新型防治手段的设计与开发提供更加系统的理论支持。目前有关弧菌致病机制等方面的研究主要依托于基因组学和蛋白质组学技术,然而这些研究方法主要集中在基因和蛋白等生物体生命活动的上游调控元件[4]。小分子代谢物作为基因和蛋白表达的末端产物,可以更直接、准确地反映生物体当前的状态。通过考察生物体内小分子代谢物水平及代谢网络的变化,可为细菌毒力调控机制的研究提供新的视角。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分,可对生物体内在生命过程中存在的代谢物进行全面表征、鉴定与定量分析,其在理解弧菌与宿主之间相互关系、揭示弧菌耐药机制及致病机制中扮演着重要角色。然而,目前基于代谢组学技术在食源性弧菌研究中的应用尚未见综述。针对于此,本文介绍了食源性弧菌的分类、代谢组学技术的分析流程及其在揭示宿主免疫应答反应、弧菌致病机制及抗生素耐药性相关研究方面的进展,有望为食源性致病弧菌的新型防控手段的开发提供新视角和新思路。

1 食源性致病弧菌

食源性致病弧菌是一种人畜共患病原菌,可导致人类或水产动物创伤性感染、败血症等,主要包括霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌等。食源性弧菌的致病性主要取决于其毒力因子(如鞭毛、肠毒素、外膜蛋白、铁磷化合物、生物被膜、黏附因子、Ⅲ型分泌系统等),而毒力因子的表达会受到群体感应系统、双组分系统、非编码sRNA分子等精密调控[5-9]。

1.1 对人类致病的食源性弧菌

食源性致病弧菌引起的人类疾病可分为两大类:霍乱和非霍乱感染。霍乱弧菌是引起人类重大流行病-霍乱的病原体,是弧菌属中对人类公共卫生影响最为严重的病原菌,具有发病急、传染性强、发病率高等特点。霍乱弧菌致病岛1(Vibrio Cholerae pathogenicity island 1, VPI-1)是霍乱弧菌基因组岛(genomic islands, GI)中最具特征的基因之一,可编码许多促进霍乱发展的毒力因子,对于霍乱弧菌的定植和霍乱毒素(cholera toxin, CT)的产生至关重要,当霍乱弧菌缺乏VPI-1时,则不会对人类产生威胁[10]。非霍乱弧菌(如副溶血性弧菌、创伤弧菌)也已成为日本、美国、泰国等国引起食源性感染的主要病原菌之一。若人食用被其污染的水产品,常会出现2～10 d的水样腹泻、腹痛,甚至出现急性肠胃炎、败血症等。由tdh和trh基因编码的热稳定直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)或TDH相关溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)被认为是副溶血弧菌的主要毒力因子。其中,TDH是一种具有中心孔的四聚体,可在脂质体上形成跨膜孔,使细胞内外的离子渗透不平衡,最终导致细胞肿胀、溶解[11]。与TDH类似,TRH能在红细胞膜中形成氯离子(Cl-)通道,导致离子通量改变[12]。与副溶血弧菌不同,创伤弧菌是一种高度致命的人类病原体,其死亡率是所有食源性病原体中最高的,确诊病例的死亡率接近50%。这归因于创伤弧菌可表达多种致命外毒素,这些毒素具有严重侵袭性和损伤力[13]。研究发现MARTX(multifunctional-autoprocessingrepeats-in-toxin)是创伤弧菌重要的外毒素之一,其可形成一种孔洞导致红细胞内Ca+内流,进而诱导了红细胞的促凝活性增加,最终引起人类红细胞形态的改变和血栓的形成[14]。这些病原体在成功定殖于生物体内后,均会通过产生一系列的毒力因子来干扰机体正常的新陈代谢,其引起的主要症状也大致相似,主要包括肠粘膜细胞受损、肠道感染等。

1.2 对水产动物体致病的食源性弧菌

鱼类、双壳类和单壳类等一系列海洋生物疾病的流行也与食源性弧菌感染密切相关。其中,溶藻弧菌是引起海洋鱼虾类患病的一种常见病菌,其可感染多种海洋生物如黑鲷、鲑点石斑鱼、黄鳍鲷、凡纳滨对虾、文蛤等,主要表现为生物体皮肤溃烂、不同部位的充血肿胀甚至死亡[15]。此外,溶藻弧菌可通过分泌大量的胞外产物(extracellular products, ECPs)逃避宿主的自然防御并干扰宿主正常的新陈代谢,已知的胞外产物包括外膜蛋白、溶血素、肠毒素、铁磷化合物、蛋白酶等,其中外膜蛋白与细菌黏附、毒力以及环境适应性等息息相关。BUNPA等人[16]从发病鱼体中分离得到的溶藻弧菌中,共鉴定出7种独特的蛋白质,其中外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmpA)的表达最强,是溶藻弧菌致病所必需的关键因子。拟态弧菌也被认为是引起水产动物患病的病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征。有研究发现拟态弧菌已严重影响我国淡水鲇养殖的生态平衡,这可能与拟态弧菌中Ⅱ型分泌系统(type II secretion system, T2SS)有关,其负责多种胞外蛋白酶和毒素的分泌,当T2SS基因簇缺失时鲇鱼的存活率上升[17]。

为了预防和控制与弧菌有关的疾病,以抗生素为代表的治疗手段在弧菌防治方面取得了一定的进展,但仍存在抗生素耐药性等安全隐患,实施新的抗生素替代品(如植物源抑菌剂、疫苗等)以控制食源性致病弧菌,是向可持续水产养殖业过渡的一个重要步骤。为了使弧菌病害防治手段的开发做到有的放矢,开展弧菌致病机制的基础研究工作就显得尤为重要。目前弧菌致病机制的研究主要集中在基因和蛋白等生物体生命活动的上游调控元件中,而代谢物是生物系统内化学反应的产物和底物,是各种生理活动综合的结果,因而更能直接、准确地反映生理和病理的结果。代谢组学被认为是用于表征小分子代谢物的高级分析方法,现在已经被广泛应用到微生物领域。

2 代谢组学技术

2.1 代谢组学的概况

代谢组学是系统生物学的重要组成部分,是一门研究生命体中所有代谢物受外部环境刺激后的变化规律的学科,能够系统的反映生物体整体或组织细胞生理功能及其与内在或外在因素的相互作用[18-19]。代谢组学技术借助生物信息学和化学计量学以及先进的分析平台,使其在整体上挖掘生物体功能信息、研究生物体内小分子代谢物变化规律等具有独特且显著的优势,已被广泛应用于食源性弧菌致病机制的研究中。

2.2 食源性致病弧菌的代谢组学分析流程

完整的代谢组学分析流程包括样品采集和提取、数据采集、数据的预处理、统计学分析、代谢物鉴定及数据解释(图1)。在生物样本的采集、预处理和制备过程中,由于细胞内的酶系活跃,代谢产物不断经历化学反应。有学者提出淬灭取样能最大程度保留细菌的代谢特征,避免生物样品在采集过程中发生额外的新陈代谢[20]。此外,细胞内代谢物化学性质(如极性、非极性)存在很大的差异性且浓度跨越范围广,为扩大化合物提取的覆盖度,常用的提取溶剂有甲醇水、甲醇/氯仿/水、甲基叔丁基醚/甲醇/水等[21]。另外对于含有羟基、巯基、氨基等极性代谢物还需进一步衍生化处理以提高质谱检测的灵敏度[22]。值得注意的是,不同弧菌之间存在特异性,培养条件也不尽相同,研究者会根据实验要求及弧菌特性优化提取溶剂的选择及配比,所以对弧菌样品的提取目前尚无统一的方法。

图1 食源性致病弧菌的代谢组学分析流程[18]Fig.1 Metabolomics analysis process of foodborne pathogenic Vibrio spp.[18]

目前,代谢组学常用的数据采集技术包括核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和MS。其中,基于NMR的代谢组学技术具有样品制备简单、无损伤性、重现性高等优势[23],但也存在灵敏度较低、动态范围有限、覆盖度小等不足。与NMR相比,MS技术拥有更高的灵敏度、更好的结构鉴定能力以及更宽的线性范围,可产生丰富的数据集,其常与气相色谱(gas chromatography, GC)、液相色谱(liquid chromatography, LC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)联用以提高检测的灵敏度及分离能力。GC-MS是代谢组学研究中较为成熟的分析平台,一般用于分离鉴定分子质量在50～600 Da的易挥发性化合物,但对于难挥发及热不稳定性的物质需要衍生化来提高其挥发性和热稳定性[24]。LC-MS是目前应用最广泛的分析平台,它结合了液相色谱技术卓越的分离能力和质谱的高分辨率和高灵敏度的特点,可对一些热稳定性差、难挥发的非极性化合物进行分析[25]。CE-MS是代谢组学研究中逐渐兴起的分析平台,与GC-MS、LC-MS相比,CE-MS适合分析一些强极性离子化合物,如有机酸、氨基酸、核苷酸等[26]。上述单一的分析平台均具有一定的偏向性,不能全面的覆盖生物体内的所有代谢物。虽然多平台可以更好地覆盖弧菌的代谢物,但高额的成本也令人们望而却步,因此提高各平台的覆盖度和灵敏度是目前亟需解决的难题。

对于仪器分析获得的代谢组学原始数据,首先要进行数据预处理,转化成可用于统计学和化学计量学分析的数据形式,再进行方法验证以确保数据的准确性和有效性。目前一些免费的第三方软件受到人们的青睐,如XCMS、MET-IDEA、MZmine、AMDIS等。这些软件可以识别大部分仪器生成的数据格式,且软件程序是开源的,可以根据用户的需求,对算法进行改进[27]。最后结合统计学分析方法(多变量分析和单变量分析)挖掘代谢组学数据中有用的信息,并借助生物信息学对代谢物进行生物解释。

3 基于代谢组学技术在食源性致病弧菌研究中的进展

近年来,代谢组学技术在理解弧菌与宿主之间的相互作用关系、揭示弧菌耐药机制及致病机制中扮演着重要的角色。其中,食源性弧菌侵袭宿主可激发机体产生一系列的代谢变化,通过统计学分析获得与宿主免疫应答密切相关的生物标志物,并结合外部验证阐明关键生物标志物的生物功能,可为后续抗菌物质的研发提供靶点。此外,代谢组学可为系统解析抗生素对细菌代谢调控机制提供有力工具,可用于揭示耐药弧菌代谢特性,阐明耐药机制并改善抗生素杀菌效果;结合代谢组学技术与分子生物学技术,可对食源性致病弧菌的毒力调控因子的具体调控功能系统地进行阐述,为弧菌新型防治手段的设计与开发提供理论依据(图2)。

图2 基于代谢组学在食源性致病弧菌研究中的策略[28-40]Fig.2 Research strategies of foodborne pathogenic Vibrio spp.based on metabolomics [28-40]

3.1 代谢组学技术在揭示宿主免疫应答方面的研究

当水产动物受到食源性弧菌侵袭时,免疫系统会激发一系列的生化反应过程来调节代谢资源分配,以支持其在应激条件下的防御和生存,然而目前人们对于食源性弧菌引起宿主的应激代谢反应尚不完全清楚。利用代谢组学技术探究弧菌与宿主之间的相互作用关系,有助于更好地理解生物系统内复杂的免疫应激过程,为弧菌病害的防治提供新的参考。富集的能量代谢对宿主抵抗病原菌至关重要,如果能量代谢调节失衡必将引起宿主组织功能障碍,进而影响宿主正常的生理代谢活动,因此了解宿主在免疫应激过程中的能量代谢是必要的。有研究发现在感染副溶血弧菌的泥蟹中,副溶血弧菌是通过减少与能量合成相关的代谢物(琥珀酸、苹果酸、乳酸)导致泥蟹不同组织中ATP含量的减少,能量代谢的减弱大大提高了泥蟹死亡的风险[28]。也有研究发现被哈维氏弧菌感染的凡纳滨对虾对能量的需求增加,主要表现为随着感染天数的增加,碳水化合物的含量始终处于整体下调的趋势,这可能是由于虾在免疫过程中会消耗大量能量,而碳水化合物可被调用参与能量代谢,进而引起其含量的降低[29]。此外,脂肪酸合成及分解途径也可在宿主受到弧菌威胁或环境胁迫时参与能量调节,应对免疫应答反应。SU等[30]研究发现感染副溶血弧菌的蛤蜊体内甘油三酯的合成途径相对于甘油三酯的脂解途径明显减弱、脂肪酸从头合成途径加强,这促进了游离脂肪酸的β氧化进而通过富集蛤蜊体内的能量代谢以应对副溶血弧菌的感染。

此外,利用代谢组学技术探寻弧菌所引起的宿主免疫应答的生物标记物,进而揭示疾病表型下宿主的深刻内在变化是目前研究的热点。YE等[31]利用1H NMR代谢学技术分析发现,与对照组相比,感染溶藻弧菌的梭子蟹肌肉中肌苷一磷酸(inosine monophosphate, IMP)水平下降了82.4%,猜测IMP是梭子蟹免疫应答过程中的潜在生物标志物,但其在宿主免疫过程中的作用并未研究。为了更深入的了解海洋生物的免疫应答反应,有学者提出了功能代谢组学,其结合生物信息学和体内外实验,系统的解释了关键生物标志物在免疫反应中的作用。GONG等[32]采用功能代谢组学的方法研究了溶藻弧菌感染斑马鱼后,死亡斑马鱼和存活斑马鱼的代谢差异,结果表明与未感染的对照组相比,死亡组中色氨酸丰度降低,而存活组的色氨酸丰度增加,进一步采用体内注射的方式给予被感染的斑马鱼外源性色氨酸并检测其存活率,发现色氨酸以剂量依赖的方式促进斑马鱼的存活。YANG等[33]发现感染溶藻弧菌后存活的斑马鱼体内三羧酸循环是受影响最大的途径,该途径中的苹果酸发生了显著上调,进一步分析发现外源注射苹果酸可以重新激活感染斑马鱼的三羧酸循环,促进牛磺酸的合成,来提高斑马鱼的生存率。总体而言,采用功能性内源代谢物不仅可以增强水产动物的抗感染力,亦可以降低耐药菌的产生,即可通过非依赖性的方法来防治弧菌感染,从而起到保护海洋生物的作用,是目前弧菌病害防治技术发展的新方向。

3.2 代谢组学技术用于抗生素耐药性相关的研究

由于抗生素在水产养殖业的广泛使用,导致耐药细菌的数量急剧增加。因此,迫切需要进一步了解细菌耐药机制和改善抗生素杀菌效果,以控制耐药性病原菌。目前,越来越多的证据表明细菌与抗菌药物接触后,可通过改变自身的代谢状态使其不被抗菌药物杀灭。通过代谢组学监测细菌在抗生素作用下的代谢反应及适应机制,可系统的了解耐药菌的生理代谢特征及耐药机制。YIN等[34]利用代谢组学技术对两种不同质量浓度(0.3 μg/mL、0.5 μg/mL)的氧氟沙星处理后的溶藻弧菌进行了分析,发现脂肪酸生物合成途径的增强能够使细菌在0.5 μg/mL的抗生素胁迫下较好的生长,进一步的分析表明抑制脂肪酸生物合成途径可阻止细菌在高剂量抗生素压力下的生长。LIU等[35]发现在抗头孢他啶的溶藻弧菌(ceftazidime-resistantV.alginolyticus, VA-RCAZ)中出现丙酮酸循环减弱、脂肪酸生物合成途径增强的代谢特征,深入发现VA-RCAZ中丙酮酸循环中的柠檬酸、琥珀酸丰度降低,而富马酸、苹果酸丰度增加,表明丙酮酸循环上游代谢可能减弱,导致下游产物的积累,促进大量的乙酰辅酶A进入脂肪酸生物合成途径,进而增强VA-RCAZ对头孢他啶的耐药性。综上所述,抑制脂肪酸代谢可作为抗生素治疗过程中预防抗生素耐药菌进化的一个潜在新策略。

此外,功能代谢组学作为一种改善抗生素杀菌效果的新型技术,其可在代谢组学阐明细菌耐药机制的基础上,通过代谢调节剂(如关键的生物标志物)对具有耐药特性的代谢通路或途径进行重编程,以干扰耐药细菌体内耐药活性物质的产生,从而增强现有抗生素介导的杀菌效果。ZHANG等[36]通过代谢组学发现抗庆大霉素的溶藻弧菌细胞内葡萄糖含量显著降低,外源添加葡萄糖能够改善庆大霉素对耐药菌的杀菌效果,这是由于葡萄糖可逆转耐药菌中氧化还原反应的减弱,促进溶藻弧菌对庆大霉素的吸收,使得抗生素杀伤作用大大提高。KUANG等[37]发现丙氨酸与庆大霉素联合使用会引起抗庆大霉素溶藻弧菌胞内的一氧化氮合酶活性及一氧化氮水平降低,进而增强庆大霉素对耐药菌的杀伤效果,而精氨酸的加入则会促进一氧化氮的形成,提高丙氨酸与庆大霉素协调作用下耐药菌的存活率。

3.3 代谢组学技术在揭示弧菌致病机制方面的研究

虽然食源性致病弧菌感染的致病机制已有研究,但每个感染阶段分子机制的潜在复杂性在很大程度上尚不清楚。代谢组学技术能对食源性致病弧菌的某个毒力因子或毒力相关基因的具体调控功能进行分析,可以从小分子层面系统地阐明弧菌的致病机制。副溶血性弧菌的三型分泌系统Ι(typeⅢ secretion systemΙ, T3SSΙ)可将不同的效应物和毒素输送到细胞质中,导致细胞毒性和严重的疾病,其包括4个效应器分别是VopQ、VopR、VopS、Vop0450。NGUYEN等[38]利用GC-MS代谢组学技术研究了副溶血弧菌毒力因子T3SSΙ的致病机制,用4株携带特定效应器(VopQ、VopR、VopS、Vop0450)的副溶血性弧菌突变株感染Caco-2细胞,发现T3SSΙ中的VopQ效应器在诱导Caco-2细胞感染中发挥了重要作用,该效应子显著改变了宿主细胞的糖酵解、三羧酸循环和氨基酸代谢,并通过耗尽细胞内谷胱甘肽和增加活性氧的产生来破坏宿主细胞的氧化还原动态平衡。RNA伴侣Hfq(host factor for RNA phage Qβ)蛋白是细菌主要的调控因子之一,参与调节各种关键的生理活动,对细菌适应不同环境和生长条件至关重要。课题组前期研究发现Hfq对溶藻弧菌的生长、环境适应能力以及毒力因子的表达具有重要的调控作用。进一步基于代谢组学和脂质组学分析方法研究了hfq的缺失对溶藻弧菌代谢的影响,分析发现hfq基因缺失可抑制支链氨基酸、芳香族氨基酸的合成,促进三羧酸循环,从而影响弧菌的逆境防御和能量代谢。此外,hfq缺失触发了游离脂肪酸和核苷的从头合成,并促进了磷脂和鞘磷脂的分解代谢,进一步调节了细胞的分裂和生长[39]。小分子非编码RNA(sRNA)被认为在细菌新陈代谢和毒力调控中发挥着重要作用,LIU等[40]鉴定了一种细胞密度依赖的sRNA分子——Qrr,采用代谢组学技术研究了Qrr对溶藻弧菌代谢的调控作用,分析发现qrr的缺失会导致大多数溶血磷脂显著上调,溶血磷脂是由甘油磷脂前体通过磷脂酶介导的脂解作用而产生的代谢物,推测qrr的缺失会加快磷脂的分解代谢,这与Δqrr菌株生长缓慢、生物膜形成减少的生理表型相一致。

值得注意的是,弧菌的致病性是多种毒力因子共同作用的结果,其中会涉及许多基因、蛋白质、信号分子的调控,仅靠代谢学技术不能完全解读弧菌复杂的致病过程。多组学整合分析克服了单个类型的“组学数据”的局限性,能够在多层面多角度系统地解释弧菌感染过程中复杂的分子机制,可极大地促进潜在抗菌靶点的挖掘和药物的开发。但目前多组学整合分析的研究还较为有限,并没有在食源性致病弧菌中广泛应用。

4 结论

代谢组学是研究生命体中小分子代谢物受外部环境刺激后变化规律的一门学科,能够系统全面地反映生物体生理功能及其与内在或外在因素的相互作用关系。近年来,代谢组学技术已被广泛应用于食源性致病弧菌的研究中,可实现对弧菌与宿主中复杂相互作用的探索,深入还原细菌耐药机制、改善抗生素杀菌效果,并从小分子层面系统地阐明弧菌的致病机制,为食源性弧菌病害的防治提供了新的理论指导。然而,代谢组技术仍处于一个不断发展的过程,还面临着诸多问题和挑战,主要体现在每一个分析平台都具有一定的偏向性,不能全面的覆盖生物体的所有代谢物。虽然多平台可以更好地覆盖弧菌的代谢物,但高额的成本也令人们望而却步,因此提高各平台的覆盖度和灵敏度是我们必须面对和亟需解决的难题。其次弧菌的致病性是多种毒力因素共同作用的结果,需要进一步的研究来充分阐明这种复杂的分子机制,多组学技术的整合将加深对弧菌发病机制的认识,可极大地促进潜在抗菌靶点的挖掘和新型药物的开发。最后弧菌所引发的疾病是一个复杂且不断变化的过程,常规的代谢组学分析获取的代谢物是静态结果,仅表征了生物反应的最终结果,代谢流分析技术则可以很好地弥补这一局限,以期为弧菌致病机制的研究提供新参考。