乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆营养品质及挥发性成分的变化

干世卿,戴杰科,徐艺橙,杨立启,聂小华*

1(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州,310014)2(杭州华味亨生物科技有限公司,浙江 杭州,311100)

乳酸菌发酵植物基饮品是近年来最受关注的益生产品,可综合植物源活性物质和乳酸菌等功能特性,且乳酸菌代谢作用可赋予植物基饮品发酵风味[1],甚至影响到植物源活性物质的结构与数量[2-3]。常见的商业化乳酸菌有植物乳杆菌、嗜酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和发酵乳杆菌等。由于果蔬基质为低酸低氮源体系,在酸胁迫和低氮胁迫下,乳酸菌生长繁殖会受到一定程度上的抑制[4]。已有研究表明,乳酸菌种类很大程度上影响着其在果蔬基质中的适应能力、发酵过程以及代谢产物,这些都与产品品质和风味密切有关[1-2,5-6],因此应选择合适的乳酸菌进行果蔬基质的发酵。

柑橘是我国重要的经济作物,富含低分子糖类、有机酸类、维生素C、纤维素和矿物质等营养成分,同时还存在着大量的酚酸、黄酮、类胡萝卜素、类柠檬苦素和香豆素等活性物质[7],尤其酚酸和黄酮是柑橘及其制品内在营养品质的特征成分[7]。现有国内外研究主要针对柑橘果汁进行乳酸菌轻度发酵[2,6,8],果皮活性物质未能得到利用。迄今为止,以柑橘全果浆为基质的乳酸菌深度发酵研究还较少[9]。

宽皮柑桔(CitrusreticulateBlanco)是一类果皮宽松、剥皮容易的柑橘品种群,年产量约占柑橘总量的60%。浙江省作为柑橘生产的主产区之一,宽皮柑桔广泛种植于温州、台州、宁波和杭州等地。本文以温州蜜桔这一宽皮柑桔为原料,采用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌为发酵菌种,比较其在宽皮柑桔全果浆中的发酵性能,综合评价其深度发酵过程中活性物质、抗氧化活性与挥发性成分的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宽皮柑桔采用温州蜜桔,产地浙江温州,选择无明显缺陷、成熟度合适的果实;植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,Lp-115)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus,La-14)和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei,Lpc-37)等冻干粉,美国杜邦公司生产。DPPH,Sigma公司;没食子酸、芦丁和维生素C,上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

LHR-150型生化培养箱,上海科学仪器有限公司;JPB-607A型便携式酸度计,上海雷磁仪器有限公司;CRZIG Ⅱ型冷冻离心机,日本日立公司;UV762型紫外可见分光光度计,上海精科实业有限公司;Trace1300-ISQ型气相色谱-质谱联用仪,美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柑橘全果浆发酵产物的制备

参考杨立启等[9]的方法。全果用次氯酸钠溶液(含有效氯0.06%)和水依次清洗后,压榨得到浑浊型全果浆,调整pH值至4.5,无菌条件下分别接种一定量的Lp-115、La-14和Lpc-37,30 ℃下发酵。

1.3.2 pH的测定

采用JPB-607A便携式酸度计测定全果浆及其发酵产物的pH值。

1.3.3 活性物质含量的测定

全果浆及发酵产物经离心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于活性物质含量的测定。维生素C含量测定采用碘量法[10];总酚含量测定采用福林酚法[5],以没食子酸为标准品;总黄酮含量测定采用氯化铝法[11],以芦丁为标准品。

1.3.4 抗氧化活性的测定

全果浆及发酵产物经离心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于抗氧化活性的测定。自由基清除能力测定采用DPPH法[6];铁离子还原力测定采用铁氰化钾法[12]。以维生素C为对照品,结果表示为g维生素C当量/L。

1.3.5 挥发性成分的测定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPEM-GC-MS)方法。按照杨立启等[9]的方法,应用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头吸附全果浆及发酵产物中挥发性成分。

GC-MS条件:DB-5 MS毛细管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);30 ℃保留2 min,以5 ℃/min升温至250 ℃,保留5 min;载气(氦气),流速1.0 mL/min,分流比10∶1。EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃,m/z40～550范围内扫描。

数据进行图谱库NIST和Xcalibur 3.0(Thermo Fisher Scientific)检索,匹配度大于80%,结合文献资料确定挥发性成分;按峰面积归一法计算每种挥发性成分的相对含量。

1.4 数据分析

每组样品平行测定3次,表示为平均值±标准偏差;主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中pH变化

宽皮柑桔全果浆中富含葡萄糖、果糖和蔗糖等低分子糖类,乳酸菌可将其代谢形成有机酸,由此引起pH下降。乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中pH变化如图1所示。结果表明,宽皮柑桔全果浆pH发生快速下降,而后趋于平缓;其中发酵3 d时Lpc-37和La-14仅将pH值降低了0.59和0.5,Lp-115则使pH发生大幅下降;发酵10 d后全果浆pH由起始的4.5分别降至2.72(Lp-115)、3.63(La-14)和3.44(Lpc-37),说明不同种类的乳酸菌在宽皮柑桔全果浆中生长情况存在明显差异。这是因为宽皮柑桔全果浆的起始pH较低(4.5),氮源匮乏,且酚酸、黄酮可能影响乳酸菌的生长[4,13];已有研究表明,乳酸菌耐受和适应环境胁迫的能力与其菌株种类有着密切关联[4]。

2.2 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中活性物质含量变化

宽皮柑桔全果浆含有丰富的维生素C、酚酸和黄酮等活性物质[7,12],其在乳酸菌发酵过程中变化如图2所示。经Lp-115、La-14和Lpc-37发酵后,宽皮柑桔全果浆中维生素C含量由起始0.73 g/L快速下降而后趋于平缓,三者之间无显著差异;发酵10 d后维生素C含量下降了70%以上。该现象常见于果蔬基质的发酵[8,14],维生素C属于烯醇,易氧化形成醌。宽皮柑桔全果浆中总酚含量呈现不断增加的趋势,其中Lp-115的作用明显强于La-14和Lpc-37,发酵10 d时分别达到3.23、2.08、1.84 g/L。这是因为全果浆为富含果肉果皮的浑浊体系,存在着大量的不溶性酚类物质,其在乳酸菌的糖苷酶和酚酸酯酶[3,15 ]作用下得到释放;同时,酚类物质在低酸环境中也不易被氧化成醌。但宽皮柑桔全果浆中总黄酮含量随发酵时间呈现截然不同的趋势,其在Lp-115发酵产物中提高1.35倍(3 d),而后维持在1.3 g/L附近;在La-14发酵产物中表现为先降后增,Lpc-37发酵产物中基本无变化(0.93～1 g/L)。一般来说,乳酸菌发酵果蔬基质中总酚和总黄酮含量得到提高[2,6,8]。推测其原因是:乳酸菌分泌的糖苷酶将不溶性膳食纤维结合的黄酮释放形成可溶性黄酮;也可能将可溶性黄酮苷水解成不溶性黄酮苷元[3]。

A-维生素C含量;B-总酚含量;C-总黄酮含量图2 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中活性物质的含量变化Fig.2 Changes in active compound contents in C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.3 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中抗氧化活性的变化

乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中抗氧化活性的变化如图3所示。经Lp-115和La-14发酵后,宽皮柑桔全果浆的DPPH自由基清除能力均呈现先增加而后基本稳定,10 d后分别达到0.47、0.33 g维生素C当量/L;铁离子还原力也得到显著提高,分别在发酵5 d和7 d达到最大值(2.82、1.89 g维生素C当量/L);但Lpc-37明显降低了全果浆清除DPPH自由基和还原铁离子的能力。推测其原因有:a)不溶性酚类物质的释放情况[3,15];b)酚类物质的结构转变[2-3];c)乳酸菌分泌抗氧化酶的能力[16];d)酚类物质的氧化程度[14,17];e)维生素C的损失状况[8,14]。众所周知,乳酸菌在果蔬基质中的生长、发酵以及分泌糖苷酶、酯酶和抗氧化酶等,存在着较大的菌株差异性。总体上,乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆的抗氧化活性依次为:Lp-115发酵产物> La-14发酵产物 >Lpc-37发酵产物,前者明显高于后二者。

A-DPPH自由基清除能力;B-铁离子还原力图3 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中抗氧化活性的变化Fig.3 Change in antioxidant activity of C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.4 乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中挥发性成分的变化

乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆过程中挥发性成分种类及相对含量如表1所示。宽皮柑桔全果浆及发酵产物中共鉴定出64种挥发性成分,包括36种烯类、10种醛类、7种醇类、4种酯类、3种有机酸类、1种酮类以及3种其他类,其中D-柠檬烯含量最高(59.73%～68.9%)。

表1 乳酸菌发酵宽皮柑橘全果浆中挥发性成分的相对含量 单位:%

烯类化合物是宽皮柑桔全果浆的重要挥发性成分,其相对含量从83.82%增加到87.11%(Lp-115)和87.62%(Lpc-37),La-14则使其降低至80.66%,说明发酵产物中烯类化合物与乳酸菌种类有关。D-柠檬烯是柑橘特征挥发性风味成分[18],相对含量发生不同程度的下降,尤其La-14发酵产物中降低了9.17%;β-榄香烯、β-萜品烯和β-月桂烯等相对含量增加了1%以上,其中前二者可赋予产品柠檬香气和茴香气味,后者可赋予产品香脂香气。

宽皮柑桔全果浆经乳酸菌发酵后,醛类化合物相对含量明显降低,己醛、辛醛、癸醛、橙花醛和紫苏醛等含量极低甚至未检出,该结果说明柑橘特有清香风味发生减弱;已有研究表明,醛类化合物在乳酸菌代谢作用下可还原成为相应的醇类化合物[19]。醇类化合物主要为芳樟醇,相对含量从起始的5.13%分别降至4.17%(Lp-115)、3.52%(La-14)和2.04%(Lpc-37);乙醇、α-松油醇和4-松油醇等相对含量显著提高,其中Lp-115发酵产物中乙醇相对含量提高较多;发酵产物中检出了微量香茅醇,可赋予产品玫瑰香气;La-14发酵产物中新增异戊醇,具有苹果白兰地香气和辛辣味。全果浆及发酵产物中酯类化合物相对含量较低(0.21%～4.13%),其中乙酸乙酯相对含量提高了0.82%(Lp-115)、3.88%(La-14)和3.07%(Lpc-37),可赋予产品甜果香味。发酵产物中均检出香芹酮,具有薄荷风味,仅Lp-115明显提高其相对含量。

宽皮柑桔全果浆中不存在短链脂肪酸,乳酸菌发酵后可检出乙酸、异丁酸、异戊酸等,其在Lp-115发酵产物中相对含量极低。发酵产物中反式-柠檬烯氧化物消失;微量的正己烷和乙偶姻检出,其中乙偶姻是乳酸菌发酵特有的代谢产物[20]。

2.5 挥发性成分的主成分分析

乳酸菌发酵宽皮柑桔全果浆中挥发性成分的主成分分析如图4所示。PC1和PC2贡献率分别为49.9%和27.5%,累积贡献率达77.4%,基本上可反映全部信息;PC1反映醇类化合物、酯类化合物、有机酸类等指标,PC2反映烯类化合物、醛类化合物和其他类挥发性成分等指标。根据距离的远近,宽皮柑桔全果浆与发酵产物相比,挥发性成分变化存在显著差异;La-14发酵5 d和发酵10 d的全果浆挥发性成分变化较为显著,Lp-115和Lpc-37发酵5 d和10 d的全果浆挥发性成分存在一定差异。该结果说明宽皮柑桔全果浆的挥发性成分受乳酸菌种类和发酵时间影响,其中La-14的影响最大,意味着柑橘特性风味向乳酸菌发酵风味的转变。

图4 宽皮柑桔全果浆及发酵产物中挥发性成分的主成分析Fig.4 PCA for unfermented and fermented C.reticulate Blanco pulps注:UF代表未发酵宽皮柑桔全果浆;Lp-115(5)和Lp-115(10) 代表植物乳杆菌Lp-115发酵全果浆5 d和10 d;La-14(5)和 La-14(10)代表嗜酸乳杆菌La-14发酵全果浆5 d和10 d;Lpc-37(5) 和Lpc-37(10)代表副干酪乳杆菌Lpc-37发酵全果浆5 d和10 d。

3 结论

本文研究了乳酸菌Lp-115、La-14和Lpc-37发酵宽皮柑桔全果浆过程中营养品质与挥发性成分的变化规律。Lp-115对宽皮柑桔全果浆的发酵能力最强,其发酵产物中总酚和总黄酮含量高于La-14发酵产物和Lpc发酵产物,但3种乳酸菌发酵产物中维生素C含量均发生明显下降;Lp-115和La-14可显著提升宽皮柑桔全果浆抗氧化活性,但Lpc-37导致抗氧化活性发生一定程度的下降。采用SPEM-GC-MS法分析全果浆及发酵产物的挥发性成分,烯类化合物、醛类化合物和芳樟醇等发生明显下降,说明柑橘特有清香风味有所下降;酯类化合物(尤其乙酸乙酯)、香芹酮和乙偶姻等有所增加,赋予了产品乳酸菌发酵风味。主成分分析表明宽皮柑桔全果浆挥发性成分很大程度上受到乳酸菌种类和发酵时间的影响,尤其La-14;与La-14和Lpc-37相比,Lp-115更适合用于宽皮柑桔全果浆的发酵生产。