栽培基质中发酵羊粪浓度对灵芝多糖含量的影响

杨郑州，谢晓娜*

（1.百色学院农业与食品工程学院，广西百色 533000；2.广西芒果生物学重点实验室，广西百色 533000；3.亚热带特色农业产业学院，广西百色 533000）

灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，是我国医学宝库中一种珍贵的食药用菌[1]。现代医学证明，灵芝具有抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病及抗衰老等功效[2]。灵芝含有丰富的营养物质和生物活性成分。研究表明灵芝的主要生理活性成分有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质、多肽、核苷类、呋喃类、甾醇、生物碱和氨基酸等[3-4]，其中的灵芝多糖、三萜类化合物是灵芝的主要活性成分。贾少杰等采用响应面分析方法对微波辅助法提取灵芝多糖工艺进行了优化，同时研究灵芝多糖抑菌活性时发现灵芝多糖对5 种供试菌均表现出抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用明显[5]。羊粪含有丰富的有机质和N、P、K 等元素，混合一定的辅料发酵之后是生产食用菌的优质培养料[6]。近年来灵芝人工栽培已经成为研究热点，但对生物有机肥基质栽培灵芝的研究却少见报道。以赤灵芝为材料，初步研究发酵羊粪栽培基质中灵芝多糖含量的变化，对羊粪资源的循环利用及灵芝培养基异源基质材料的探究具有创新意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种为赤灵芝，由百色学院农学院食用菌基地提供。发酵羊粪由山东丰润农资有限公司提供。培养基材料由桉木屑、杂木屑、羊粪、石膏、麦麸、石灰粉等组成。

1.2 试验方法

1.2.1 栽培料配方

以赤灵芝为研究对象，设置5 组不同羊粪添加浓度的配方（详见表1）。灵芝栽培方法为袋料栽培，选用聚乙烯塑料袋填料，每个配方8袋，3次重复。于高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌2 h，冷却至室温，于超净工作台进行接种，在温度26～28 ℃、湿度60%～65%、避光条件下培养，菌丝满袋后开袋出芝并移至大棚，保持温度26～28 ℃、湿度85%～90%。每袋子实体仅留存最健壮的一个，当菌袋干瘪养料耗尽，子实体菌盖整体呈褐色时，采收子实体。

表1 灵芝栽培料配方 单位：%

1.2.2 羊粪有机质及总养分质量分数的测定

1）羊粪有机质的测定。用定量的重铬酸钾-硫酸溶液，在加热条件下，使有机肥料中的有机碳氧化，多余的重铬酸钾用硫酸亚铁标准溶液滴定，同时以二氧化硅为添加物作空白试验。根据氧化前后氧化剂耗量，计算有机碳含量，乘以系数1.724，为有机质含量[7]。

2）羊粪总养分质量分数的测定（N+P2O5+K2O）。总氮的测定：有机肥中的有机氮经过硫酸-过氧化氢消煮，转化为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨，用硼酸溶液吸收，以标准酸溶液滴定，计算样品中总氮含量[7]。磷含量测定：有机肥试样采用硫酸和过氧化氢消煮，在一定酸度下，待测液中的硫酸根离子与偏钒酸和钼酸反应生成黄色三元杂多酸。在一定浓度范围内，黄色溶液的吸光度与磷含量呈正比例关系，用分光光度法测定磷含量[7]。钾含量测定：有机肥料试样经过硫酸和过氧化氢消煮，稀释后用火焰光度法测定。在一定浓度范围，溶液中钾浓度与发射强度成正比例关系[7]。每个处理重复3次。

1.2.3 超声波法提取灵芝多糖

采收不同配方的灵芝子实体粉碎成末。称取1.0 g过20 mm 孔径筛的样品粉末，置于50 mL 具塞离心管内，用5 mL 水浸润样品，加入20 mL 无水乙醇，震荡摇匀，置于超声波清洗机中于120 W、60 ℃条件下提取30 min，提取结束后，于4 000 r·min-1离心10 min弃去上清液，不溶物用10 mL 乙醇溶液（80%）洗涤、离心。用水将上述不溶物转移至圆底烧瓶，加入50 mL水，于120 W、60 ℃下超声提取30 min，重复2 次。冷却至室温，过滤，将上清液转移至200 mL 容量瓶中，残渣洗涤2～3 次，洗涤液转至容量瓶，加水定容。此溶液为样品待测液。如多糖含量较高，可适当稀释后进行分析测定。

1.2.4 苯酚硫酸法测定多糖含量

糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm 处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系，利用分光度计测定其吸光度，在标准曲线上查出样品的多糖含量[16]。具体试剂配制、试验步骤及多糖含量计算方法参考《SN/T 4260-2015 出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。

2 结果与分析

2.1 羊粪质量检测结果

由表2 可知试验所用发酵羊粪肥料中，有机质含量最高，钾含量其次，磷含量较低，氮含量最低。羊粪中含有丰富的有机质，在灵芝栽培过程中主要为灵芝生长提供碳源。碳源是提供食用菌生长发育碳素的重要营养来源。食用菌吸收的碳约有20%被用来合成细胞和代谢产物中的碳架结构，80%被用来维持生命活动所需的能量[8]。因此，利用发酵羊粪栽培灵芝不失为一种好的羊粪资源的无害化处理方式。

表2 重复性试验验证 单位：%

2.2 不同羊粪添加浓度下灵芝菌袋污染率比较

据表3 可知，随着发酵羊粪在栽培基质中的占比越来越大，菌袋污染率也随之升高，由此推测羊粪添加量与菌袋污染率呈正相关。在羊粪添加量为0%时，菌袋污染率仅为8.33%；而在灵芝栽培基质中羊粪含量占比达45%时，菌袋污染率高达62.5%。造成这种趋势的原因是灵芝菌丝无法充分分解羊粪中的养分，而一些霉菌微生物适应性强，添加羊粪使其竞争力大大提高，抑制了灵芝菌丝生长，造成菌袋污染。

表3 不同羊粪添加浓度下灵芝菌袋污染率统计

2.3 不同羊粪添加浓度下菌丝生长速度比较

利用SPSS 软件对试验数据进行单因素方差分析。据表4 可知，不同羊粪添加量下的灵芝菌丝生长速度差异极显著（p<0.01）；10%试验组、20%试验组、30%试验组菌丝生长速度与对照组之间差异极显著（p<0.01），45% 试验组与对照组无显著差异（p＞0.05）。表明随着羊粪添加量的增加，灵芝菌丝生长速度呈现先升高后下降的趋势。羊粪添加量在0%～20%之间，菌丝生长速度呈现上升趋势；羊粪添加量大于20%时，菌丝生长速度显著下降。当羊粪添加量为20%时，菌丝生长速度达到最大；10%试验组和30%试验组菌丝生长速度相近，仅次于20%试验组。30%试验组和45%试验组菌丝生长速度下降的原因可能是培养料中羊粪作为碳源占比过大导致料内碳氮比不适宜灵芝菌丝生长，菌丝体活性下降，分解养分能力不足。

表4 不同羊粪添加浓度下菌丝生长速度比较

2.4 不同羊粪添加浓度下灵芝的多糖含量比较

利用SPSS 软件对试验数据进行单因素方差分析。据表5 可知，不同配方所得灵芝子实体的多糖含量差异极显著（p<0.01）；同一配方下所得样品的多糖含量无显著差异。10%试验组、45%试验组和对照组样品之间的多糖含量无显著差异；20%试验组、30%试验组与其他各组样品的多糖含量差异极显著（p<0.01）。随着羊粪添加剂量的升高，样品的多糖含量呈现先升高后降低的趋势，且差异极显著（p<0.01），其中20%试验组中样品多糖含量最高，30%试验组次之。

3 结论与讨论

试验结果显示发酵羊粪中含有丰富的有机质，可作为灵芝生长的碳源；此外羊粪含有丰富的有机质和N、P、K 等元素，混合一定的辅料发酵之后是生产食用菌的优质培养料。本次研究结果还表明发酵羊粪添加量与菌袋污染率呈正相关；对照组与20%、30%试验组的菌丝生长速度、样品多糖含量均存在极显著差异（p<0.01）；20%试验组所得灵芝的菌丝生长速度、多糖含量最大。因此在实际生产中可以添加较低剂量的发酵羊粪(20%～30%)来改良灵芝培养基，提高灵芝品质。此外，培养过程中也要保持环境严格无菌，将菌袋污染率控制在合理范围内，以降低生产材料的耗损率。在灵芝菌丝生长过程中，保持一定的温度、湿度，及时补水、通风，适当添加一些营养物质调节料内碳氮比，可以促进菌丝生长，缩短灵芝生长周期，达到增产的目的。利用畜禽粪便和农作物秸秆等栽培食用菌不仅是对农业废弃物的资源化利用，而且生产出高营养价值和经济效益的食用菌，栽培后的菌渣还能还田作肥料，真正实现了资源的多层次循环利用。

随着近年来农牧业的迅速发展，规模化养殖场逐渐增多，如何解决羊粪堆积、防止环境污染，保证人畜健康已成为养殖者面临的重大问题。据报道羊粪含有有机质24%～27%、氮0.7%～0.8%、磷0.45%～0.6%、钾0.4%～0.5%。羊粪的有机质含量比其他畜粪多，粪质较细，肥分浓厚[8]。试验所购羊粪的有机质含量略低于上述报道标准，总氮含量低于报道标准，磷含量和钾含量远远高出报道标准。形成这种差异的原因可能在于所使用的羊粪来源不同，如羊的品种、产地、所喂食料的不同均有可能造成羊粪养分含量的差异。也有可能是羊粪发酵过程中有机质养分被某些微生物所利用，导致一定量的损耗和流失。刘大彻等用羊粪培育金针菇，结果显示袋栽金针菇比瓶栽产量高[9]。任爱民研究发现用麦草羊粪培养料栽培双孢蘑菇具有出菇早、产量高、品质好的优点[10]。毛伟娟利用牛粪和大蒜秸秆等农村固体废弃物生产食用菌，1 m2菇床可生产8 kg 双孢蘑菇[11]。雅梅用干羊粪和禾草堆肥发酵制作菌菇培养料，因羊粪中含有一些杀菌物质，与其他粪肥发酵制作的培养基相比较，羊粪培养料污染和生虫的概率更低[12]。为明确蟹味菇菌渣的堆肥效果，明晰菌渣与猪粪、羊粪、稻草等原料在堆肥过程中的碳氮转化效率和损失，干莹莹等按湿质量比设菌渣、菌渣与猪粪、菌渣与羊粪进行堆肥试验，结果显示纯菌渣堆肥后有机肥总养分含量高，但产出量较低，发酵过程中碳氮损失多，相对于猪粪，羊粪的C/N 高，养分含量低[13]。梁明勤等报道用杏鲍菇菌糠和玉米芯为主料，麸皮、石膏和过磷酸钙为辅料，添加不同比例的猪粪沼液栽培平菇1618，结果表明其菌丝生长速度显著高于CK，菌丝长势也好于CK[14]。据统计，早在2000年国内养殖所产生的畜禽粪便等废弃物达到27 亿t，到2018 年高达38 亿t，2020 年时全国产生42.44 亿t 的畜禽粪便废弃物，成为中国最主要的农业污染源之一[15]，因此畜禽粪便废弃物的资源化利用成为亟待解决的问题。