基于网络药理学与分子对接探讨黄芪桂枝五物汤治疗大动脉炎的作用机制

汪佳丽 徐少华 付 琦 刘 涛

广西中医药大学附属国际壮医医院心胸血管外科，广西南宁 530201

大动脉炎（takayasu arteritis，TA）是一种慢性肉芽肿性血管炎，主要累及主动脉及其主要分支，如颈动脉、椎动脉、头臂动脉、锁骨下动脉等动脉[1]，主要症状包括关节和肌肉疼痛、全身不适、发烧、盗汗。约10%患者表现为血管炎症状，如胸背部、颈部疼痛、腹痛等[2]。其治疗方法包括药物和手术治疗，药物治疗分为诱导缓解期和维持期，治疗药物主要包括糖皮质激素（glucocorticoid，GC）以及非GC类免疫抑制剂。在诱导缓解期，主要的治疗方法是将GC与免疫抑制剂联合使用；在维持期，将GC逐渐减量维持，但未详细说明具体剂量[3]。

中医将TA归于“血痹”“瘀证”“无脉症”等范围，黄芪桂枝五物汤出于《金匮要略》，为东汉医家张仲景所著[4]；《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》篇述：“血痹阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤主之。”其病机为气血虚弱，腠理不固，外受风寒，阳气受阻，血行不畅[5]。临床研究表明，黄芪桂枝五物汤对于缓解TA的相关症状具备独特效用[6]，但其作用机制暂不明确。本研究探讨了黄芪桂枝五物汤治疗TA的作用机制，为黄芪桂枝五物汤的应用提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 方剂靶点 用TCMSP数据库对黄芪桂枝五物汤中组成进行检索，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18为条件，获得活性成分预测其靶点，再利于UniProt数据库，获得黄芪桂枝五物汤药物基因集。

1.1.2 TA疾病靶点 利用GeneCards数据库搜索TA疾病相关靶点，得到疾病相关基因集。

1.2 方法

1.2.1 “药物-成分-靶点”可视化网络 将1.1.1和1.1.2中数据导入CytoScape软件，通过“药物-成分-靶点”可视化展示。

1.2.2 蛋白相互作用网络 STRING数据库由交集基因导入，得到蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络并利用CytoScape软件可视化展示。

1.2.3 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析 将交集基因导入DAVID数据库行GO与KEGG富集分析，选取前20个条目使用微生信气泡图展示。

1.2.4 分子对接 以度中心性（degree centrality，DC）值排列，选取排名前4的活性成分和基因行分子对接，计算结合能；运用AutoDockTools将两者对接，利用PyMol软件对结果可视化。

2 结果

2.1 活性成分

黄芪桂枝五物汤共76个活性化学成分，部分见表1。

表1 黄芪桂枝五物汤活性药物成分

2.2 交集基因

UniProt数据库由464个黄芪桂枝五物汤药效靶点导入，得到160个预测靶点对应基因，GeneCards数据库搜索TA共726个靶点基因，运用Venny取交集基因，得到44个黄芪桂枝五物汤治疗TA的预测靶点，见图1。

图1 黄芪桂枝五物汤治疗TA预测靶点图

2.3 药物-成分-靶点网络

利用CytoScape软件构建“药物-成分-靶点”网络可视化，见图2。根据DC值排序，排列较前为quercetin、kaempferol、beta-sitosterol等，数值各为208、69、59。证明上述为黄芪桂枝五物汤治疗TA的主要活性成分，发挥着重要作用。

2.4 PPI网络

将交集基因导入STRING数据库构建PPI网络图，见图3。将STRING数据库得到的文件导入CytoScape软件，筛选核心蛋白，见图4。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白蛋白（albumin，ALB）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等为筛选出的核心蛋白，在整个网络中起着关键作用。

图3 PPI网络

图4 PPI可视化

2.5 GO与KEGG富集分析

使用DAVID数据库对交集基因行富集分析，GO富集分析得到GO条目共402个，其中340个生物过程（biological process，BP）；28个细胞组分（cellular component，CC）；34个分子功能（molecular function，MF）。KEGG通路富集得出105条通路。利用P值排序，选取前20个条目运用微生信工具以气泡图可视化，见图5。结果显示，黄芪桂枝五物汤对TA的治疗主要涉及白介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路等，可能通过对炎症反应、细胞凋亡过程的负调节、脂多糖的反应等发挥治疗作用。

图5 GO、KEGG富集分析图

2.6 分子对接

选取排名前四的关键活性成分和靶点进行分子对接，见表2。表中关键活性成分和关键靶点中结合能≤-5 kJ/mol占比93.8%，预测该活性成分与靶点具有较好的结合活性，证明黄芪桂枝五物汤关键活性成分可对关键靶点的调控发挥作用。见图6。

图6 关键活性成分与关键靶点对接可视化

表2 关键活性成分与关键靶点对接的结合能

3 讨论

网络药理学作为一门新兴学科，是药理学、分子生物学、医学、生物信息学以及统计学综合运用的结果[7]。网络药理学是一种新方法，通过了解中药配伍多成分、多通路和治疗多靶点[8]，能够证明中药对疾病的治疗作用。网络药理学的发展始终与中医药研究息息相关[9]，并为中医药发展带来新生机。

目前临床对于TA的治疗，主要以GC以及非GC类免疫抑制剂等药物及手术治疗为主，但其存在耐药及其他副作用，而新兴的靶向治疗仍缺乏足够的证据支持[10]。不同的是，中医讲究整体和辨证施治，在治疗TA上展现了独特的优势，如庞鹤教授[11]应用黄芪桂枝五物汤治疗周围血管疾病。

本研究表明槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊异黄酮可能是黄芪桂枝五物汤治疗TA的关键活性成分。槲皮素治疗炎症性疾病机制是通过抑制炎症因子的生成和细胞基质的降解，其抗炎作用是通过调控相关炎症信号等通路[12]。山奈酚是一种黄酮醇，被证实属天然抗炎化合物之一，在关节炎、癌症、心血管疾病和其他疾病的发病过程中都发挥着重要作用，并与降低炎症相关疾病的风险密切相关[13]。β-谷甾醇可以通过降低血管内皮细胞表面的血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1以及E-选择素的表达水平，阻止炎性中性粒细胞的移行、浸润从而减轻细胞炎性反应[14]。毛蕊异黄酮为一种异黄酮植物雌激素，是从中药黄芪中提取的有效活性成分之一[15]。毛蕊异黄酮有促进血管新生、抗氧化等作用，通过转录学和实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法，发现毛蕊异黄酮通过VEGF和FGF信号通路实现其中Src，Raf，丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2（protein kinase 1/2，MEK1/2）和磷脂酰肌醇3酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）起着不可代替的作用[16]。

IL-6调节多种细胞的生长和分化，调节免疫反应、急性期和造血，并通过机体对感染的免疫反应发挥重要作用；TNF具有抗感染、促进机体免疫功能调节等重要作用；VEGFA的体外活性是促进动脉、静脉和淋巴管内皮细胞的生长。

KEGG通路富集结果主要有IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等，涉及脂多糖的反应、炎症反应、细胞凋亡过程的负调节等功能发挥治疗作用。NF-κB在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起着关键作用；IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期触发因子，并通过促进促炎细胞因子的释放来增强炎症反应；IL-17结合受体后，可通过MAP激酶途径和NF-κB发挥生物效应。所以黄芪桂枝五物汤治疗TA的机制可能是通过减轻血管炎症，疏通血管，恢复血流速度，也就是“温经益气，和血通痹”的作用，充分阐明了中医理论中“通则不痛”。

分子对接结果显示结合能≤-5 kJ/mol占93.8%，证实了山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素、毛蕊异黄酮在治疗TA中的重要作用。

综上所述，本研究借助网络药理学及分子对接技术，阐述了黄芪桂枝五物汤对TA的治疗是通过槲皮素 、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊异黄酮等成分作用于IL-6、TNF、ALB、VEGFA等基因靶点，从而影响“IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路”等通路发挥作用，为进一步研究中药治疗TA提供参考。但此课题只对其作用机制进行了初步验证，由于数据库收录信息的不完整、相关数据更新滞后等因素影响，该研究存在一定的局限性，故开展实验验证应是下一步研究的重点。