基于Nrf2-GPX4 通路介导铁死亡研究卒中后认知功能障碍的中医治疗及疗效

陈俊 杨杰 冯海松 濮捷 陈博

卒中后认知功能障碍是缺血性脑卒中后常见的后遗症，表现为记忆力和理解力降低、交流困难，直接影响患者生活、也增加家庭和社会负担［1］。中医认为该病属于“健忘”、“痴呆”、“郁证”等范畴，病机在于正气虚弱、痰瘀互结、闭阻经络，治疗应以益气活血、化瘀通络为主［2］。补阳还五汤是益气活血的代表方，出自清代的《医林改错》，临床实践中多用于气虚血瘀证的治疗［3］。有研究报道补阳还五汤用于脑卒中的治疗能够改善偏瘫［4］，但对认知功能的影响及相关机制尚不明确。现代生物医学研究认为核因子红细胞2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）通路是调控铁死亡的重要信号通路之一，卒中后认知功能障碍的发生与Nrf2/GPX4通路异常有关［5］，补阳还五汤对脑损伤大鼠模型的治疗作用与调控Nrf2/GPX4 通路有关［6］。为初步认识补阳还五汤治疗卒中后认知功能障碍的疗效及机制，本研究对补阳还五汤治疗卒中后认知功能障碍的疗效及其对Nrf2-GPX4 通路介导铁死亡的影响展开分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020 年12 月至2022 年5 月期间湖北省中医院（湖北中医药大学附属医院收治的卒中后认知功能障碍患者作为研究对象，入组标准：①符合《卒中后认知障碍管理专家共识（2017）》［7］中的诊断标准，病程≤6 月；②首次发生卒中；③意识清楚、无吞咽功能障碍。排除标准：①合并其他影响认知功能的疾病；②合并恶性肿瘤；③合并精神疾病；④合并肝肾功能不全；⑤对研究所用药物过敏。共纳入84 例患者，根据随机数字表分为观察组（n=42）和对照组（n=42）。两组患者一般资料的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。本研究经湖北省中医院医学伦理委员会批准，取得入组患者或家属的知情同意。

表1 两组患者一般资料的比较［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

表1 两组患者一般资料的比较［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

1.2 治疗方法

两组患者进行抗血小板、降脂稳定斑块、降压、降糖等基础治疗，对照组加用奥拉西坦胶囊、800 mg/次 口服、3 次/d。观察组加用奥拉西坦胶囊、800 mg/次 口服、3 次/d 及补阳还五汤 每日1剂、水煎取汁400 mL、分早晚2 次服用。补阳还五汤由医院药剂科制备，成分为黄芪30 g，当归、赤芍、川芎各10 g，桃仁、红花、地龙各5 g。两组均以4 周为一个疗程、连续治疗3 个疗程。

1.3 观察指标

1.3.1 认知功能评分

治疗前及治疗后3 个疗程，参照专家共识［7］、采用简易精神状态检查量表（Mini-mental State Examination，MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）评价认知功能。

1.3.2 中医证候积分

治疗前及治疗后3 个疗程，参照《中药新药临床研究指导原则》［8］进行中医证候积分的评价。

1.3.3 外周血Nrf2、GPX4 表达的检测

治疗前及治疗后3 个疗程，在血常规采血管内采集空腹外周静脉血2 mL，由同一名人员采用北京天根生化科技公司生成的试剂盒进行检测，均按照试剂盒说明书进行操作。采用全血RNA 分离试剂盒提取外周静脉血的RNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒将RNA 反转录为cDNA，采用荧光定量检测试剂盒检测Nrf2、GPX4 的mRNA 表达水平。

1.3.4 血清MDA、8-OHdG、TfR1 的检测

治疗前及治疗后3 个疗程，在生化采血管内采集空腹外周静脉血5 mL，静置30 min 等待自然凝血，在离心机中按照温度4℃、半径10 cm、转速3 000 r/min 离心10 min，分离血清后由同一名人员采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）进行丙二醛（MDA）、8-羟基脱氧尿苷酸（8-OHdG）、转铁蛋白受体1（TfR1）的检测，均按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理。计数资料用n（%）描述，行χ2检验；计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验、组内采用配对样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后MoCA 评分、MMSE 评分的比较

治疗前，两组患者MoCA 评分、MMSE 评分比较的差异无统计学意义（P＜0.05）；治疗后，两组患者的MoCA 评分、MMSE 评分高于治疗前且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者治疗前后MoCA 评分、MMSE 评分的比较（）Table 2 Comparison of MoCA score and MMSE score before and after treatment between the two groups（）

表2 两组患者治疗前后MoCA 评分、MMSE 评分的比较（）Table 2 Comparison of MoCA score and MMSE score before and after treatment between the two groups（）

2.2 两组患者治疗前后中医证候积分的比较

治疗前，两组患者中医证候积分比较的差异无统计学意义（P＜0.05）；治疗后，两组患者的中医证候积分低于治疗前且观察组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组患者治疗前后中医证候积分的比较（）Table 3 Comparison of TCM syndrome scores before and after treatment between the two groups（）

表3 两组患者治疗前后中医证候积分的比较（）Table 3 Comparison of TCM syndrome scores before and after treatment between the two groups（）

2.3 两组患者治疗前后外周血Nrf2、GPX4 表达的比较

治疗前，两组患者外周血Nrf2、GPX4 mRNA表达水平比较的差异无统计学意义（P＜0.05）；治疗后，两组患者的外周血Nrf2、GPX4 mRNA 表达水平高于治疗前且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组患者治疗前后外周血Nrf2、GPX4表达的比较（）Table 4 Comparison of Nrf2 and GPX4 expression in peripheral blood of patients before and after treatment between the two groups（）

表4 两组患者治疗前后外周血Nrf2、GPX4表达的比较（）Table 4 Comparison of Nrf2 and GPX4 expression in peripheral blood of patients before and after treatment between the two groups（）

2.4 两组患者治疗前后血清MDA、8-OHdG、TfR1含量的比较

治疗前，两组患者血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量比较的差异无统计学意义（P＜0.05）；治疗后，两组患者的血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量高于治疗前且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两组患者治疗前后血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量的比较（）Table 5 Comparison of serum MDA，8-OHdG and TfR1 contents before and after treatment between the two groups（）

表5 两组患者治疗前后血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量的比较（）Table 5 Comparison of serum MDA，8-OHdG and TfR1 contents before and after treatment between the two groups（）

3 讨论

缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病，脑组织缺血缺氧损害是疾病的基本特征，患者可出现运动功能、语言功能、认知功能等损害，不仅影响患者的日常生活，也极大地增加家庭和社会的负担。近些年，卒中后认知功能障碍在脑卒中康复过程中的不利影响受到越来越多关注，针对性地改善认知功能具有重要的临床意义［9-10］。

西医治疗卒中后认知功能障碍的手段包括抗血小板、调脂、抗氧化等基础治疗以及多奈哌齐、奥拉西坦等改善认知治疗，但疗效并不尽如人意。中医疗法在缺血性脑卒中及其后遗症的治疗中展现出独到优势，脑卒中属于中医理论的“中风”范畴，卒中后认知功能障碍属于中医理论的“健忘”、“郁证”范畴，多由气虚血瘀引起［11］。补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中常用的中药方，方中君药黄芪能补气通络，臣药当归能活血祛瘀，配合赤芍、川芎、桃仁等药物能够针对气虚血瘀发挥益气活血的功效，进而改善缺血性脑卒中患者的肢体运动、语言等神经功能［12］。

本研究使用补阳还五汤对卒中后认知功能障碍进行治疗，结果显示：在西医治疗基础上加用补阳还五汤治疗后，患者的认知功能及中医证候明显改善，提示补阳还五汤对卒中后认知功能障碍患者的认知功能具有改善作用，可能的中医机理是该汤剂发挥益气活血通络，使卒中后认知功能障碍患者的气虚血瘀得到纠正、闭阻经络得到改善，最终使认知功能优化、中医证候减轻。现代生物医学对补阳还五汤中多味药物的研究认为黄芪、赤芍、川芎、桃仁等药物具有改善血流灌注、清除自由基、减轻炎症反应等作用，与该汤剂益气活血通络的功效对应［13］。本研究将进一步探索补阳还五汤治疗卒中后认知功能障碍的分子生物学机制。

卒中后认知功能障碍涉及的生物学环节复杂，包括炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡、细胞自噬及新近发现的铁死亡［14］。铁死亡作为一种新型细胞死亡方式，以铁超载和脂质过氧化为特征，与组织损伤过程中的炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡等环节密切相关。有动物实验证实，补阳还五汤对糖尿病小鼠的铁死亡具有抑制作用；有网络药理学研究证实，补阳还五汤对缺血性脑卒中的铁死亡具有抑制作用［15］。铁死亡的生化特征是TfR1 表达增加以及氧化产物MDA、8-OHdG 释放增加。相关临床研究证实，血清MDA、8-OHdG 等标志物的含量增加与缺血性脑卒中后神经损害加重、认知功能障碍有关。本研究对上述指标的分析显示：在西医治疗基础上加用补阳还五汤治疗后，患者血清中TfR1、MDA、8-OHdG 含量均降低，提示补阳还五汤用于卒中后认知功能障碍的治疗能够发挥抑制铁死亡的作用。

综上所述，补阳还五汤中医治疗改善卒中后认知功能障碍患者的认知功能及中医证候，激活Nrf2-GPX4 通路、减轻铁死亡是与之相关的分子机制。