王朗国家级自然保护区斑尾榛鸡肠道菌群多样性初步分析

罗学群,朱 琪,周 航,黄朝霞,廖光炯,张文平,杜世章,熊先华,王金玲,花东来*

(1.绵阳师范学院资源环境工程学院,四川绵阳 621000;2.绵阳师范学院生命科学与技术学院/大熊猫国家公园岷山生物多样性监测分析实验室,四川绵阳 621000;3.北川羌族自治县国有林场,四川绵阳 622700;4.大熊猫国家公园绵阳管理分局,四川绵阳 621000;5.四川小寨子沟国家级自然保护区管理处,四川绵阳 622750)

0 引言

斑尾榛鸡(Tetrastessewerzowi),属于鸡形目松鸡科榛鸡属鸟类,是中国特有鸟类,主要分布于青海、甘肃、四川、云南西南部和西藏东部高海拔的山林中[1].由于自然形成的斑块生境、气候变化以及人为干扰,斑尾榛鸡的栖息地出现严重破碎化,其适宜区域面积呈现递减趋势[2].再加上狩猎、天敌、寄生虫等多种因素,斑尾榛鸡种群数量急剧减少,被中国濒危动物红皮书列为“濒危”鸟类[3].斑尾榛鸡的模式物种来自甘肃莲花山,由王香亭等[4]发现并记录,初步研究了斑尾榛鸡活动规律、食性、繁殖习性、天敌等.斑尾榛鸡的研究区域也多在莲花山保护区内[1],其次是青藏高原地区[5],对四川王朗国家级自然保护区的斑尾榛鸡健康状况方面的研究鲜有涉及[6-7].由于肠道菌群与宿主的健康和习性关系密切[8],因此,为了更好地保护斑尾榛鸡,本文以王朗自然保护区作为研究地点,分析斑尾榛鸡菌群特征,以期为因地制宜制定该物种管理和保护策略提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 粪便样品收集

研究组在查阅相关资料并在巡山人员的指引下,于2022—2023年通过粪便形状等特征对小寨子、王朗两个保护区进行了疑似斑尾榛鸡粪便样品的收集工作,共采集了7份样品,其中小寨子三份,王朗竹根岔两份,王朗回头线沟和白沙沟各一份.取样时,为避免交叉污染均戴有一次性无菌薄膜手套,采集的粪便放入50 mL无菌离心管中,再倒入无水乙醇淹没整个粪便,运输回实验室后低温保存.

1.2 粪便宿主物种鉴定

QIAamp© Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen,德国)可有效减少细菌DNA的含量,增加宿主DNA的浓度.因此采用该试剂盒进行粪便DNA提取用于宿主物种鉴定,具体步骤参照该试剂盒说明书,最后溶于50 μL试剂盒自带的TE缓冲液中.

然后用引物(Forward:5’>ATGAAGGGATGTTCTACTGGTTG<3’;Reverse:5’>AACATCTCCGCATGATGAA<3’)扩增鸟类的Cytb序列,目的片段长度为1200 bp[9-10].PCR扩增在40 μL反应混合液中进行:2×T8 High-Fidelity Mast 20 μL, Forward primer (10 μM) 2 μL, Reverse primer (10 μM) 2 μL, DNA模板2 μL, ddH2O 14 μL.PCR反应条件是:预变性98 ℃ 2 min,变性98 ℃ 10 s,退火55 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 15 s,最后总延伸72 ℃ 5 min,4 ℃ 保温,共37次循环.PCR产物在北京擎科生物科技股份有限公司成都分公司进行测序.最后将得到的序列上传到NCBI进行blastn分析.在比对结果中,将在NCBI上比对得到的同源性在99%以上且同源度最高的、排序靠前的、物种信息明确的物种作为鉴定的参考物种.

1.3 粪便样品菌群分析

为提高肠道菌群DNA的纯度,采用PowerFecal© DNA Isolation Kit(MOBIO,美国)进行粪便菌群DNA提取.将大约0.25 g样品加入到试剂盒提供的PowerBead Tubes中,其余步骤参照试剂盒,最后采用DNA溶解液(试剂盒配备)溶解DNA,并将DNA浓度调整到50 ng/μL.

粪便菌群分析采用细菌的16S rRNA V3-4的通用引物338F(5’>ACTCCTA CGGGAGGCAGCA<3’)、806R(5’>GGACTACHVGGGTWTCTAAT<3’)[11].总体积为30 μL的PCR反应体系为:2×reaction buffer (KOD FX Neo Buffer)15 μL,KOD FX Neo 0.6 μL, dNTP(2.0 mM each)6 μL,Forward primer(10 μM)0.9 μL,Reverse primer(10 μM)0.9 μL,DNA Template 1 μL,ddH2O 5.6 μL.PCR反应条件是:预变性98 ℃ 2 min,变性 98 ℃ 30 s,退火 50 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 60 s,最后延伸72 ℃ 5 min,4 ℃ 保温,共30次循环.PCR产物的建库及测序在北京擎科生物科技股份有限公司进行,采用illumina Novaseq 6000 PE250进行测序.

每份样品的原始数据下机通过去除接头和barcode,然后进行质量筛查得到高质量的序列.同时,从NCBI上下载了50份来自红原鸡的粪便菌群16S rDNA v3-4的数据[12]用于本研究.

对得到的双端序列采用QIIME2(版本号2021.2,https://qiime2.org)[13]进行分析,包括利用FLASH软件(版本号1.2.7)[14]进行配对连接,重叠区域的碱基长度大于10 bp,且不允许错配;采用DADA2的流程进行质控和feature输出结果(100%相似度);feature的分类信息采用SILVA参考数据库(version 138)[15].菌群的α和β多样性分析采用QIIME2流程,数据的可视化基于在线网站https://view.qiime2.org进行.组间菌群差异分析采用Wen[16]的方法,可视化基于该文献提供的edgeR火山图流程.

2 结果

2.1 粪便宿主鉴定

粪便DNA宿主的Cytb序列显示小寨子的1个样品来自绿尾虹雉;王朗的1个样品来自红喉雉鹑,2个样品来自斑尾榛鸡;剩下的3个样品由于提取的粪便宿主DNA扩增失败而不能鉴定物种.其中,在王朗竹根岔采集的粪便样品虽然Cytb扩增失败,但其粪便形态与已经确认来自斑尾榛鸡的比较相似,两样品采集点间距在5 m左右,因此该样品也来自斑尾榛鸡,有较高可信度(见讨论部分).这样来自王朗的3份样品用于本研究的斑尾榛鸡菌群分析.

2.2 王朗斑尾榛鸡肠道菌群组成

对下机序列进行拼接、质控、去除低质量序列和嵌合体后,3个样本共获得194 296条合格的16S rDNA序列,每个样本的有效序列数48 704～76 068条.基于100%相似度的feature稀释性曲线显示各个样本曲线均趋向平坦(图1),说明测序所得序列能够完全展示各个样品细菌群落多样性,可以进行后续分析.

王朗斑尾榛鸡细菌群落分属31个门.表1显示了门水平的细菌群落结构组成,其中丰度占比小于0.01的物种归为others.结果显示王朗斑尾榛鸡菌群主要的门类为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)等.王朗斑尾榛鸡还有大量的未分类的菌群,平均相对丰度为11.7%,在样本WZ07F中高达33.7%.

在属分类水平上共检测到的细菌覆盖了582个细菌属,如表2所示,所有样本中丰度占比小于0.01的物种归为others,占比为2.9%～34.6%.结果显示平均相对丰度占比前10的优势属为Pseudomonas、Escherichia_Shigella、unclassified_Cyanobacteriales、Paenibacillus、unclassified_Muribaculaceae、Sporosarcina、unclassified_Lachnospiraceae、uncultured_Bacteroidales_bacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Lactobacillus.同时,大量的序列不能归入已知属,表2中的名称前加-unclassified来表示,这显示王朗斑尾榛鸡中有大量的未知菌群.

斑尾榛鸡菌群的α多样性结果显示其多样性覆盖度均高于99%,表明测序结果覆盖度较好且具有很高的可信度.三个样本的Chao 1和ACE指数与观察到的feature数一样(图2A).Shannon指数和Simpson指数反映群落分布多样性,Shannon指数越大、Simpson指数越小,说明群落多样性越高.本研究中样本WZ07F的Shannon指数最高,而其Simpson与WZ08F比较接近.等级丰度曲线可直观地反映样本中物种的丰富度和均匀度,三个样本中,样本WZ07F等级丰度曲线在横轴上的跨度最大,因此该样品菌群的丰富度最高;同时,该样本在垂直方向上曲线最平缓,因此其菌群分布较均匀.

图2 王朗斑尾榛鸡肠道菌群alpha多样性(A和B)和等级丰度曲线(C)Fig.2 The Alpha diversity results (A and B) and Rank Abundance Curve (C) of gut bacteria of Wanglang grouse

2.3 王朗斑尾榛鸡肠道菌群与红原鸡的差异分析

以Puetz[12]发表的红原鸡菌群作为对照,用于评估王朗斑尾榛鸡菌群组成的多样性和健康情况.为了比较群体之间的菌群差异,只在一个样本中出现的feature被过滤,同时序列数少于3的低丰度菌群也被过滤,这样总共1 238个feature用于比较红原鸡和斑尾榛鸡之间的菌群差异.红原鸡和斑尾榛鸡菌群alpha多样性指标,包括Pielou evenness,Richness和Shannon,差异并不显著(P>0.05).基于Bray-Curtis距离、Jaccard指数、Unweighted UniFrac距离和Weighted UniFrac距离的主成分分析(PCoA)显示红原鸡和王朗斑尾榛鸡的菌群差异显著(图3).Bray-Curtis距离和Weighted UniFrac距离未能区分红原鸡和斑尾榛鸡(图3A和3D),但Jaccard指数和Unweighted UniFrac距离均显著将这两个物种的菌群分开(permanova-pairwise,p<0.001)(图3B和3C),表明王朗斑尾榛鸡与红原鸡的菌群差异主要在于稀有菌群上.图4显示了红原鸡和斑尾榛鸡菌群的菌群差异情况,图中标注了差异最大的5个feature,其中斑尾榛鸡富集的feature分别属于大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter),红原鸡富集的feature分别属于罗斯氏菌属(Romboutsia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus).

(A) Bray-Curtis距离(B) Jaccard指数(C)Unweighted UniFrac 距离(D)Weighted UniFrac 距离图3 红原鸡和王朗斑尾榛鸡肠道菌群主成分分析(PCoA)Fig.3 the PCoA results of gut bacteria of Wanglang grouse and red junglefowl in this study

图4 红原鸡和王朗斑尾榛鸡肠道菌群差异分析火山图Fig.4 The volcano map of gut bacteria difference analysis between red roosters and Wanglang grouse

3 讨论

本研究在2023年2月和5月对王朗自然保护区斑尾榛鸡主要活动区域竹根岔、白沙沟、回头线沟进行了采样.经过Cytb序列鉴定,发现白沙沟WB07F样品和竹根岔采集的WZ07F样品鉴定为斑尾榛鸡,而回头线沟的样品鉴定为红喉雉鹑(Tetraophasisobscurus).来自竹根岔的另外一个样本WZ08F由于提取的宿主DNA量太少未能通过物种鉴定,该样本与WZ07F样本采集点距离较近且粪便形态相似.由于斑尾榛鸡的迁徙能力较弱且成群活动,因此WZ08F有很大可能也来自斑尾榛鸡.

食性、年龄和季节均会影响鸟类肠道菌群的多样性.以昆虫为食物的大山雀肠道菌群以变形菌门、厚壁菌门和软壁菌门为主,而以种子为食物的个体肠道菌群以变形菌门、软壁菌门和蓝细菌门为主[17].王娟[18]等综述了不同食性野生鸟类的肠道微生物特征,研究发现植食性鸟类食物组成较为单一,肠道微生物多样性相对较低,以变形菌门、放线菌门和厚壁菌门为主,而杂食性鸟类肠道微生物因食物组成多样,主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门为主.从目前的研究结果来看,大多数研究表示斑尾榛鸡是植食性鸟类,主要以柳、榛的鳞芽、叶和云杉种子以及其他植物的花、花序、叶、嫩枝梢为食[4,19],但仍有斑尾榛鸡觅食昆虫的报道,比如斑尾榛鸡取食小毛虫、伪步行虫、金花虫等,在5—7月的繁殖季节,雌性斑尾榛鸡也经常食用无脊椎动物(主要是蚂蚁)[19-20].本研究结果显示王朗地区斑尾榛鸡肠道优势菌门含有变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门等(表1),这个结果与莫麒颖[17]的发现一致.根据王娟等[18]的结果,我们推测王朗地区的斑尾榛鸡属于杂食性.

红原鸡的肠道菌群作为对照用于评估王朗斑尾榛鸡的肠道菌群健康状况.结果显示,与红原鸡菌群相比,斑尾榛鸡富集的菌包括大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)(图4).志贺氏菌属和假单胞菌属是肠道机会致病菌,其丰度增高可导致微生态失调,因此与消化道的多种疾病密切相关[21].节杆菌属细菌大多存在于环境中,可以降解诸多苯衍生物、多环芳烃、N-杂环化合物等环境有机污染物[22],但其在宿主体内的作用还鲜有报道.而红原鸡中富集的菌包括罗斯氏菌属(Romboutsia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)(图4)有助于维持肠道微生态平衡、抵抗疾病[23].因此,相对于红原鸡,斑尾榛鸡肠道微生态失调的风险更高.有研究发现幼鸟和成年鸟的肠道微生物组差异较大[24].因此,为了更好地分析王朗地区斑尾榛鸡的菌群特征,还需要开展更广泛的研究工作,包括收集不同季节和不同年龄斑尾榛鸡的粪便样品.

尽管本研究只有三份样本来自斑尾榛鸡,但这三份样本来自王朗保护区的2个斑尾榛鸡主要分布地,因此在一定程度上反应了王朗保护区斑尾榛鸡的菌群情况,为后续大规模研究奠定了坚实的基础.