基于网络药理学和生物信息学探讨并验证槲皮素治疗肝癌的靶点和机制❋

柳 卓,谭小宁,翦慧颖,曾普华,

(1.长沙医学院,长沙 410219;2.湖南省中医研究院,长沙 410006;3.湖南省中医药研究院附属医院,长沙 410006)

世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, ARC)发布了2021年全球最新癌症数据,全世界被确诊为肝癌的人超过90万,肝癌死亡的人超过83万,死亡人数接近发病人数。2021年中国有超过41万人新患肝癌,超过39万人死于肝癌[1]。肝癌的致病原因目前主要认为是乙型和丙型肝炎病毒、非酒精脂肪性肝病、长期酗酒、进食黄曲霉毒素等导致[2]。目前肝癌治疗方法有手术疗法、放化疗、肝移植、介入及药物治疗等。但肝癌的治疗和预后相对较差,副作用较多且费用也较高。因此,找到治疗效果确切且毒副作用较小的辅助药物为研究热点[3]。

中医药对肝癌的治疗是我国肝癌患者重要的治疗手段之一,许多中药提取物都显示出对肝癌有抑制作用,从中药成分或植物来源中找到的一些天然化合物既能保护正常细胞不受影响,又能对癌细胞有杀伤力,但目前中药成分药理机制仍然不明确。槲皮素是广泛存在于中药中的天然黄酮类化合物,被认为是一种有效的癌症治疗剂和抗氧化剂,同时也是肿瘤治疗剂和自噬介质,已经被证明能通过多种途径治疗肝癌、肺癌等不同恶性肿瘤[4]。近年来,有体外试验已表明槲皮素对肝癌细胞凋亡和细胞周期有阻滞作用,并具有抑制肿瘤转移、抗血管生成、化疗增敏作用、调节肝脏脂质代谢、增强抗炎作用,并呈现浓度和时间依赖性[5]。在体内实验表明槲皮素能逆转癌前病变[6]。目前,针对槲皮素治疗肝癌的研究虽在不断深入,但仍无针对其有效的具体分子机制研究。因此,本文基于网络药理学和生物信息学,对槲皮素治疗肝癌的分子靶点及通路进行预测及分子对接进行验证,为槲皮素对肝癌研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 HepG2细胞为湖南省中医药研究院附属医院中心实验室惠赠。Hep3B细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司(货号CL-0102)。HuH-7细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司(货号CL-0120)。

1.1.2 试剂 DMEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司(货号PM15210);电致化学发光(electrochemiluminescence,ECL)发光液购自白鲨生物科技有限公司(货号BL520B);醛糖还原酶(aldoketo reductase family 1 member B1,AKR1B1)一抗购自安诺伦(北京)生物科技有限公司(货号GTX113381);胎牛血清购自美国Gibco公司(批号 A316081);槲皮素购自南京景竹生物科技有限公司(货号117395)。

1.1.3 仪器 SW-CJ-2F型超净工作台,苏州安泰公司);TG16-WS型高速离心机,湖南赛特湘仪公司;OPERETTA型高内涵成像分析系统,美国PerkinElmer公司;EIX808U型酶标仪,美国BioTek公司;Min-PROTEAN Tetra电泳仪,美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 收集和处理槲皮素靶点 使用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集槲皮素的成分信息。并从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找的槲皮素3D结构导入到PharmMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中预测分子靶点。将化合物预测产生的靶点进行重复性的筛选剔除,结合临床试验文献报道补充槲皮素的靶点,并将其录入UniPtot(https://www.uniprot.org/)剔除非人源的靶点。

1.2.2 肝癌疾病相关靶点及槲皮素与肝癌相关靶点收集 通过GeneCards(https://www. genecards. org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)搜索肝癌相关靶点,筛选并删除重复的靶点,并利用Ri386 4.0.5软件找出1.2.1收集的槲皮素作用于肝癌的作用靶点。

1.2.3 网络调控靶点分析 将槲皮素作用肝癌的关键靶点信息输入String11.0(https://www.string-db.org/)数据库构建蛋白质相互作用网络,得到蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network, PPI),并将信息输入Cytoscape 3.6.2进行网络分析,得出平均最短路径、聚类系数、度值等。

1.2.4 槲皮素调控肝癌相关通路分析 采用Ri386 4.0.5软件、Cytoscape 3.6.2软件的app GlueGO插件及DAVID 6.8,对槲皮素对肝癌作用关键靶点的GO和KEGG进行分析,选取阈值P小于0.05的靶点,并根据P值从小到大筛选。从基因靶点的分子功能(molecular function,MF)、参与生物过程(biological process,BP)和细胞成分(cell components,CC)三个方面进行分析,利用R语言下载“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”数据包进行交叉靶点KEGG路径富集分析综合预测槲皮素与肝癌关键调控通路。

1.2.5 分子对接结果分析

1.2.5.1 分子对接结果 将找出的所有槲皮素对肝癌的作用靶点共76个,去除掉非人源性基因和不能结合的基因,剩余70个,在PDB(https://www1.rcsb.org/)分别搜索70个靶点蛋白保存为PDB格式。将70个药物-疾病关键靶点分别与配体槲皮素(MOL2格式)用iGEMDOCK分子对接软件进行分子对接,参数均采用默认参数。

1.2.5.2 系统分子对接结果 将槲皮素治疗肝癌的70个作用靶点的PDB ID输入Systemsdock数据库,找出活性位点,用ChemBio3D 软件保存槲皮素mol2 3D 结构,输入应用AutoDockVina开始对接整理结果并分析得到系统分子对接结果。

1.2.6 槲皮素对人肝癌细胞的作用验证

1.2.6.1 细胞培养 HepG2和Huh-7在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,Hep3B细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基中培养。并放在37 ℃、5%CO2和饱和湿度的细胞培养箱中。

1.2.6.2 分组和给药 取1×106对数长期HepG2、Huh-7、Hep3B,分别设对照组、阳性组(顺铂20 μg/mL)和槲皮素组100 μmol/L,每组设置6个复孔。各组均接受药物干预24 h。

1.2.6.3 CCK8检测槲皮素的抑制作用 首先取50、100、150、200、250 μmol/L五个浓度梯度对HepG2细胞进行24 h的干预,按照CCK8试剂盒方法检测其光密度(optical density,OD)值。

取20、50、100 μmol/L三个不同浓度梯度槲皮素分别干预HepG2、Huh-7、Hep3B培养24 h后,弃掉上清,每孔加入CCK8,37 ℃培养2 h,于450 nm波长处,用酶标仪测定各孔吸光值(OD值)。

1.2.6.4 测定各组细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β 对数成长期HepG2细胞,以5×102个接种于6孔板,各组药物干预24 h后,采用ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.6.5 Western blot检测 取HepG2细胞,各组药物处理24 h后,提取蛋白,取含有100 μg总蛋白的细胞裂解产物进行电泳,5%脱脂奶粉进行封闭1 h,加入稀释一抗AKR1B1(1:1 000)4 ℃孵育过夜,清洗后二抗摇床孵育2 h,清洗后用凝胶成像[7]。

1.2.6.6 高内涵(high content screening, HCS)检测AKR1B1蛋白表达量 取黑色96孔板接种细胞,4组加入相应药物,干预24 h。4%多聚甲醛固定30 min,弃液,磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗5 min,重复3次。Trition-100处理15 min,提前冷藏PBS洗3次。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭30 min。分别加入(1∶100)兔抗小鼠AKR1B1一抗稀释液避光4 ℃过夜孵育,冷PBS洗3次,加入(1∶200)FITC标记的山羊抗兔二抗稀释液避光37 ℃ 30 min孵育,加入DAPI染核,避光室温20 min孵育,每孔加入50 μL PBS,于高内涵成像分析系统上进行荧光检测并拍照[8]。

2 结果

2.1 槲皮素的化学结构及靶点信息

根据文献和数据库PharmMapper得到槲皮素已报道的靶点共325个,通过Uniprot数据库删选不重复的靶点共299个,包括HSP82、syd、Nup214、ALB、PKLR等,度值最高的为ALB,其次为PKLR。槲皮素的化学2D和3D结构见图1,其结构以色酮为基本结构并包含五个酚羟基,分子排列紧密引力较大,不易溶解限制了其在动物体内的生物利用度。

图1 槲皮素的结构

2.2 肝癌相关靶点数据构建及比对分析

在GeneCards、OMIM、TTD数据库共删选出了24395个疾病基因,将三个数据库去重后共得到17359个疾病基因,GeneCards选择分数>40的数据,共筛选出214个靶点。对槲皮素靶点与肝癌的相关发病机制靶点进行比对后得到共76个作用靶点基因,除去重复的基因后得到70个靶点基因,利用Cytoscape 3.6.2绘制槲皮素对肝癌作用靶点的互作网络关系图,见图2,将槲皮素治疗肝癌的潜在70个作用靶点和疾病靶点通过Ri386 4.0.5得出韦恩图,疾病靶点比较表现出潜在的70个作用靶点均在肝癌的靶点内,见图3。将70个作用靶点输入到String数据库去除掉无相互作用的靶点后导出PPI图。得到槲皮素对肝癌的作用靶点共有72个节点,平均聚类系数为0.598,共有538个边数,平均度数为14.2,见图4。根据R语言matrix算法分析在string中槲皮素与肝癌靶点基因数据得出较相关的基因有IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MYS、CCND1、ERBB2、FOS、AR、PPARG、RELA、CASP8、HIF1A、NOS3、ICAM1、PTGS1等,其中IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA等靶点数较多,见图 5,槲皮素对肝癌作用靶点的拓扑学分析见表1,包括了最短路径、介数、中心接近度、聚类系数、度数等。

表1 槲皮素治疗肝癌靶点拓扑分析(度值前30个靶点)

图2 槲皮素治疗肝癌作用靶点的蛋白质相互作用网络关系

图3 槲皮素治疗肝癌作用靶点的韦恩图

图4 槲皮素治疗肝癌靶点PPI图

图5 槲皮素治疗肝癌影响相关基因统计

2.3 槲皮素治疗肝癌靶点的GO和KEGG分析

经R语言及David数据库对核心靶点进行GO分析,见图6、表2,并将前10位的CC、MF、BP筛选出来,包括GO分组编号及P值。GO分析共得到33个CC,P值靠前的有胞浆、细胞外间隙、细胞质、膜筏、核质等;63个MF,P值靠前的有酶结合、相同蛋白结合、转录因子结合、蛋白质结合、蛋白质异二聚活性等;353个BP,P值靠前的有RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控凋亡过程的负调控、凋亡过程的负调控、对雌二醇的反应、细胞对缺氧的反应等。

图6 槲皮素治疗肝癌靶点GO图

将槲皮素治疗肝癌的靶点用David数据库及R语言进行KEGG信号分析,共包含72条通路,根据P值筛选出前7条,见图7,将通路名称、相关基因及P值汇总到表3,气泡图显示气泡越大基因个数越多,气泡越蓝,P值越小,显著性越高。主要包括癌症相关途径、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、凋亡、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、p53信号通路等,在肝癌发病机制中均有报道,可见GO和KEGG方法是可行的,结果显示对槲皮素对通过这些通路对肝癌起效[9-11]。

表3 槲皮素治疗肝癌靶点KEGG分析

图7 槲皮素治疗肝癌靶点的KEGG气泡图

2.4 槲皮素-肝癌作用靶点分子对接结果分析

2.4.1 分子对接结果 将肝癌的70个潜在靶点分别与槲皮素进行分子对接,结合能量越低时配体与受体结构越稳定,选出结合能力最强的前5个分子,其中分子对接结合能力较强的有AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1,结合能力最强的为AKR1B1、其次是NQO1,见表4。

表4 槲皮素治疗肝癌分子对接结果

2.4.2 系统分子对接结果 槲皮素对肝癌对接结果表示槲皮素与MYC、STAT3、EGFR、MAPK1、CASP3、VEGFA等21个靶点的系统对接分值大于5,表明槲皮素与肝癌的作用靶点有较好的结合活性,将靶点名称、PDB编号、系统对接得分、分子对接得分总结见表5。综合结合能力最好的是AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1。由此可见基因AKR1B1可能在槲皮素治疗肝癌中有重要的作用。

表5 槲皮素治疗肝癌的分子对接分数

2.5 槲皮素对人肝癌细胞的作用

2.5.1 不同浓度槲皮素对人肝癌细胞的抑制率 槲皮素对HepG2细胞CCK8结果表示,其对肝癌细胞有抑制作用,并随着其浓度的增加,增值抑制作用逐渐增强,细胞数变少。IC50=98.54 μmol/L,见图8。

注:半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)

与对照组比较,不同浓度槲皮素组和顺铂组干预HepG2、Huh-7、Hep3B细胞后,增殖下降,并且浓度越高,抑制能力越强,并具有统计学意义(P<0.05),见表6。

表6 不同浓度槲皮素分别干预三种肝癌细胞24h后增殖影响

2.5.2 槲皮素干预HepG2细胞后TNF-α、IL-6、IL-1β浓度 与对照组比较,槲皮素和顺铂组TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著降低(P<0.05),可见,槲皮素能降低肿瘤细胞的炎症因子的表达量,验证了槲皮素治疗肝癌与炎症因子有关,见表7。

表7 各组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β浓度

2.5.3 槲皮素干预HepG2细胞后AKR1B1表达实验结果 通过Western blot实验,发现槲皮素组和阳性药物组中AKR1B1的表达明显低于对照组,并具有统计学意义(P<0.05)。槲皮素的表达低于阳性药物组,无统计学意义,见图9、表8。

表8 Western blot检测槲皮素干预HepG2细胞后AKR1B1的蛋白表达

注:醛糖还原酶(AKR1B1)A.对照组;B.槲皮素;C.顺铂组。

2.5.4 HCS检测HepG2细胞的AKR1B1实验结果 HCS实验(图10、表9)发现槲皮素组和阳性药物组中AKR1B1的表达明显低于对照组,并具有统计学意义(P<0.05)。槲皮素的表达低于阳性药物组,差异无统计学意义。由此可见,槲皮素对肝癌的作用可能与AKR1B1有关。

表9 高内涵(HCS)细胞成像分析系统检测醛糖还原酶(AKR1B1)在HepG2中的蛋白表达

注:醛糖还原酶(AKR1B1)A.对照组;B.槲皮素;C.顺铂组

3 讨论

肝癌是全世界第五大最常见癌症和第三大癌症死亡原因。现在肝癌的治疗主要是以手术为主,但术后的高复发率始终影响着患者的生活和生存发展。中药存在作用靶点多、成分较多的特点,现代研究表明,中药抗肝癌具有明显的作用[12-13]。槲寄生总碱能通过造成细胞内钙超载引起肝癌细胞凋亡[14]。槲皮素广泛分布于被子植物的中药中,已有体内体外及临床研究均表明其具有诱导肿瘤细胞凋亡及抑制生长的作用,但其机制仍然不完全明确[4]。现代药理研究表明,槲皮素能增加E-cadherin蛋白的表达使得抑制转化生长因子 (transforming growth factor,TGF) -β1诱导肝癌细胞EMT得到抑制[15]。Ren[5]研究表明槲皮素纳米粒通过灭活凋亡相关的caspase通路,抑制炎症因子而具有抗肿瘤作用。但仍不能系统揭示槲皮素治疗肝癌的关键靶点机制。由于槲皮素不稳定并且溶解性差,限制了临床使用,现在有研究将槲皮素和纳米颗粒结合可以通过多靶点作用有效地抑制肝癌细胞增殖、细胞迁移和集落形成从而提高其疗效并减少副作用[5]。

本研究通过化合物数据库找出槲皮素对肝癌相关靶点76个,筛选出70个。GO分析表明槲皮素抗肝癌细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相关信号及凋亡作用的靶点有原癌基因(MYC)、醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase,NQO)1等。KEGG分析表明槲皮素治疗肝癌的关键靶点主要是通过癌症相关通路、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、凋亡、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。因此,槲皮素可通过以上几种方式来发挥治疗肝癌的作用。KEGG分析发现除了癌症相关通路外,炎症细胞因子也有很大的相关性。

从分子对接的结果中分析,共有21个关键靶点系统对接分值大于5,其与MYC、信号转导和转录激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT)3、表皮生长因子受体(epidermal growth factor recptor,EGFR)、MAPK1、人胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)结合活性较好。而结合能力最好的是AKR1B1、NQO1、内皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、细胞色素P450(cytochrom P450,CYP)3A4酶、Ras关联域家族(ras association domain family,RASSF)1。可见AKR1B1基因可能在槲皮素治疗肝癌中起重要作用。在体外研究表明,槲皮素组和阳性药物组AKR1B1的表达明显低于空白对照组。槲皮素的表达低于阳性药物组,炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达降低。可见,槲皮素可能与AKR1B1结合后有抗癌作用,其机制可能与炎症有关。

综上,通过网络药理学和生物信息学技术,辅助实验验证,探讨槲皮素在治疗肝癌的过程中的分子机制及其潜在靶点,更深入地研究了有效成分—靶点—疾病的相互作用,为肝癌的中医药治疗提供了新药研制方向及机制研究思路。但由于数据库资料的不全面,使得本研究具有一定的局限性。因此接下来将对槲皮素治疗肝癌的基础机制进行更深入的验证和探讨。