一株弯曲固氮菌对多环芳烃的降解特性研究

张宏宏 叶晨 张晓昀 孟恬 王黎明 黄玉屏

[摘 要]微生物修复在多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）污染治理方面有着优良特性。为了获得高效降解PAHs的微生物，以荧蒽为唯一碳源进行筛选，分离得到一株高效降解细菌，命名为CE3。经16S rDNA序列分析法鉴定，菌株CE3属于弯曲固氮菌属（Azoarcus），这是首次发现该属菌株对高分子量PAHs具有降解能力。菌株CE3除了能降解荧蒽，还能降解苯、菲、芘、荧蒽、苯并[a]蒽、3-4苯并芘和苯并[b]荧蒽，且对荧蒽和芘的降解率较高，均达到50%以上。分析各种条件对CE3菌降解荧蒽和芘的影响，发现CE3菌能在较广的温度和pH范围降解荧蒽或芘，并且添加酵母提取物、蔗糖和果糖可使CE3菌降解能力提高。

[关键词]多环芳烃；荧蒽；芘；降解；弯曲固氮菌

[中图分类号]Q939.99; X53[文献标识码]A

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）是一类含有两个及两个以上苯环的有机化合物，具有遗传毒性、致突变性、致癌性、生物蓄积性和化学稳定性^[1-3]，是我国农用和居住用地土壤评估的重要指标之一。根据环数的不同，PAHs可以分为高分子量PAHs（4环及以上）和低分子量PAHs（2～3环），且高分子量PAHs比低分子量PAHs具有更高的稳定性、更强的致癌性、致畸性和致突变性，对人类健康和生态环境产生的危害更大^[4-5]。我国大部分地区表层土壤中整体上都含有一定量的PAHs，并多处于中度污染水平，其中4环的PAHs荧蒽和芘含量较高，2环的PAHs含量较低^[6]。例如本研究的供试土壤采样区湖北黄石新冶钢有限公司东钢厂区，其焦化車间受到的多环芳烃污染十分严重，其中大部分为高分子量多环芳烃污染物。由于在环境中低分子量的PAHs比高分子量的容易降解，因此对高分子量PAHs的污染治理非常重要。在PAHs污染治理方法中，微生物治理方法因其环境友好、成本低、高效等特点，成为了PAHs污染治理的热点^[7]。然而，目前分离到的降解高分子量PAHs菌株非常有限，对其降解机制所知甚少。为此，迫切需要分离更多的高分子量PAHs降解菌，探明它们对高分子量PAHs的代谢机制，从而加快微生物在环境污染治理和修复中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土壤样品的采集 本研究所用土壤样品采自湖北省黄石市新冶钢有限公司东钢厂焦化车间，取距表层10 cm下的土壤。

1.1.2 培养基

1）无机盐培养基 （1 L）：338.8 mg KH₂PO₄、234.0 mg （NH₄）₂SO₄、100.0 mg Na₂CO_3、3.9 mg CaCl₂、59.3 mg MgSO₄·7H₂O、890.7 mg Na₂HPO₄·12H₂O、0.3 mg FeSO₄·7H₂O，1 mL 微量元素母液。

2）微量元素母液（1 L）：1500 mg FeCl₂·4H₂O、190 mg CoCl₂·6H₂O、100 mg MnSO₄·7H₂O、70 mg ZnCl₂、24 mg NiCl₂·6H₂O、24 mg NaMoO₄·2H₂O、6 mg MnCl₂·4H₂O、2 mg CuCl₂·2H₂O。

1.1.3 试剂与仪器 除上述培养基配方中的化学试剂（购自国药集团化学试剂有限公司）外，本研究试剂主要有：菲、荧蒽、芘、3-4苯并芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、丙酮、二氯甲烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）（购自阿拉丁工业公司）。本研究所用实验仪器包括岛津UV2500型分光光度计、Agilent 1200高效液相色谱仪、Ultimate PAH高效液相色谱柱（5 μm， 250 mm×4.6 mm）等。

1.2 实验方法

1.2.1 多环芳烃降解菌的分离纯化 称取10 g混合土壤样品，加入90 mL无菌水和适量玻璃珠振荡3 h；静置待土壤沉降后，取10 mL上清液接入加有荧蒽的90 mL无机盐培养基中，30℃、180 r/min培养7 d。每次均按10％的体积比移取培养液接入新鲜的液体无机盐培养基中，进行富集培养，共重复5次。富集培养时培养基中荧蒽的浓度依次为10、20、40、60、80 mg/L。之后，将培养液进行稀释涂布，并将单菌落在平板上进一步划线分离纯化。

1.2.2 降解菌的鉴定

1）菌株形态特征的观察：a）挑取单菌落分别在LB平板和含有荧蒽的无机盐平板上划线，30℃培养，观察菌落形态，并进行革兰氏染色。b）将菌株接入含有荧蒽的无机盐培养基中，30℃、180 r/min培养，观察其在液体无机盐培养基中的生长状态。

2） 菌株的分子生物学鉴定：用细菌 16S rDNA 通用引物 （ 27F： 5-CAGCGGTACCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R： 5-CTCTCTGCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）进行PCR扩增，将PCR产物送公司测序。将序列信息输入NCBI 网站，经 Blast 程序与 GenBank 中已有的核酸序列进行序列同源性比对分析，并用MEGA 11.0软件采用Neighbor-Joining法构建菌株的系统发育树。

1.2.3 多环芳烃浓度的测定 将活化之后的菌液8000 r/min离心5 min，弃上清，用无机盐培养基洗涤2次，再用无机盐培养基将菌体重悬；将菌液OD₆₀₀调至1.0，按所需的接种量转接于50 mL加有多环芳烃为单一碳源的无机盐培养基中，30℃、180 r/min培养7 d。

1）分光光度法检测多环芳烃

a）配制各种多环芳烃溶于甲醇的标准品，用岛津UV2500分光光度计做全波段扫描，来确定每种多环芳烃对应的最大吸收波长。

b）分别在各种多环芳烃的最大吸收波长处测定不同浓度梯度标准样品的吸光度，以吸光度值为纵坐标，多环芳烃的浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定加标回收率，计算变异系数，分析重复性。

c）向50 mL 培养液中加入25 mL 二氯甲烷，振荡萃取30 min，之后倒入分液漏斗中，静置15 min，分层后收集下层的有机相，上层的水相按同样的方法连续萃取2 次。

d）合并3次萃取获得的有机相，离心去掉有机相中残留的水分，并测量有机相的体积。

e）测定于上述有机相样品在最大吸收波长下的吸收值，并根据标准曲线计算多环芳烃的浓度和降解率。

2）高效液相色谱法测定荧蒽和芘

a）绘制荧蒽和芘的标准曲线

配制不同浓度梯度的荧蒽和芘的标准样品，上机分析。分析的色谱条件为：流动相为V（甲醇）∶V（水）=9∶1，紫外检测器室温检测，设置流速为1 mL/min，进样量为30 μL，检测波长为254 nm，分析时间为30 min。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标分别绘制荧蒽和芘的标准曲线。

b）培养液中加入等体积的二氯甲烷萃取，振荡萃取30 min，倒入分液漏斗中，静置15 min，分層后收集有机相，水相重复萃取2次。

c）将有机相离心，去掉残留的水分后，用旋转蒸发器进行旋转蒸发，水浴温度为40℃；向蒸干后的圆底烧瓶中加入50 mL色谱纯的甲醇，充分溶解多环芳烃。

d）取1 mL上述多环芳烃甲醇溶液，过滤除去杂质，制得待测样品。将待测样品上机检测，根据检测结果和标准曲线计算荧蒽及芘的浓度和降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌株CE3的形态特征

通过逐次提高培养基中的荧蒽浓度，并用平板划线分离纯化，筛选得到一株高效降解荧蒽的菌株，编号CE3。菌株CE3在LB平板（图1a）和无机盐平板（图1b）上的菌落呈规则圆形，透明，淡黄色，凸起，表面光滑湿润，质地粘稠易挑起。菌株CE3为革兰氏阴性菌，菌体呈略弯曲的棒状（图1c）。菌株CE3在含有荧蒽的无机盐培养基中培养时，随着荧蒽被降解，培养液逐渐变清亮，菌体呈絮状聚集（图1d）。

2.2 菌株CE3的分子生物学鉴定

菌株CE3的16S rDNA序列GenBank 登录号为 MT 498785，Blast序列同源性比对显示其菌株CE3与Azoarcus（固氮弯曲菌）属细菌的16S rDNA序列同源性高，核苷酸一致性均达95%以上，其中与Azoarcus evansii DQS-4的16S rDNA序列同源性最高。系统发育分析也表明菌株CE3与弯曲固氮菌属（Azoarcus）的菌株亲缘关系较近（图2），故初步将菌株CE3鉴定为Azoarcus sp. CE3。

2.3 菌株CE3的多环芳烃利用范围

实验发现，除荧蒽外，菌株CE3能在以苯、芘、菲、3-4苯并芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽为唯一碳源的无机盐培养基中生长。为此，检测了菌株CE3对各种高分子量PAHs的降解能力（表1）。结果表明菌株CE3对几种高分子量PAHs都有一定的降解能力，对荧蒽和芘的降解率超过了50%。故后续对菌株CE3在不同条件下降解荧蒽和芘的能力进行了详细分析。

2.4 菌株CE3降解特性的研究

2.4.1 培养温度对菌株CE3降解率的影响 未接种细菌的对照组中荧蒽和芘浓度在不同培养温度下无明显差别，说明温度对荧蒽和芘的自身散逸没有显著影响。菌株CE3降解荧蒽和芘的最适温度均为30℃，温度提高到35℃时，CE3菌对芘的降解率略有降低，但对荧蒽的降解率则下降了一半（图3）。菌株CE3在25～45℃条件下都能生长，但温度超过40℃时CE3菌的生长受到明显抑制，降解率也明显降低。因此，后续的实验都在30℃条件下进行。

2.4.2 不同接菌量对菌株CE3降解率的影响 降解体系中的PAHs含量恒定时，不同的接菌量对降解率也有明显影响。实验结果表明，接菌量从2%到8%时，菌株CE3对荧蒽的降解率逐渐提高，最高降解率达到58.9%；增加接种量到10%时，降解率反而降低。芘的降解率变化与荧蒽的不同，当接菌量为6%时，菌株CE3对芘的降解率达到最大值60.2%。其他不同比例接菌量下，芘的降解率无明显差别（图4）。

2.4.3 荧蒽或芘初始浓度对菌株CE3降解能力的影响 菌株对PAHs耐受能力的研究是探究其降解特性的重要一环，本研究测定了不同初始培养浓度下菌株CE3对荧蒽和芘的降解效率（图5）。初始浓度为100 mg/L时，菌株CE3对荧蒽和芘的降解率最高，分别达到50.8%和65.3%，因此，后续实验中荧蒽或芘的初始浓度均为100 mg/L。在荧蒽和芘浓度较高时，菌株CE3仍具有一定的降解能力，说明菌株CE3能耐受高浓度荧蒽和芘，具有应用于高浓度荧蒽或芘污染治理的潜力。

2.4.4培养基的初始pH对菌株CE3降解率的影响 pH值会影响酶的活性、物质的转运过程和营养物质的利用^[8]，从而影响微生物的代谢过程，因此本研究探究了培养基初始pH对菌株CE3降解荧蒽和芘效率的影响（图6）。培养基初始pH值在5～10之间时，菌株CE3对荧蒽和芘的降解率先随着pH值的增加而增加，当pH为8时CE3菌对荧蒽的降解率达到最高，随后pH越高降解率越低；而菌株CE3对芘的降解率在pH 9时达到峰值，当pH为10 或8时，芘的降解率也没有明显降低。由此可见，菌株CE3比较适应弱碱性环境，而酸性环境对其生长和降解活动明显不利。

2.4.5 不同外源营养物质对菌株CE3降解率的影响 微生物需要碳源、氮源、磷源、钾和铁等保证其正常代谢和生长^[9]，不同的共代谢底物也是影响微生物降解PAHs的因素之一^[10]。本研究选择蔗糖（A）、果糖（B）、葡萄糖（C）、麦芽糖（D）、木糖（E）、酵母提取物（F）、蛋白胨（G）作为外源营养物质，探究它们对菌株CE3降解荧蒽和芘能力的影响。结果显所示，各种营养物质对菌株CE3降解荧蒽和芘的影响不同，酵母提取物使菌株对荧蒽和芘的降解率分别提高了12.3%和5.8%，蛋白胨使菌株对荧蒽和芘的降解率分别提高了5.7%和3.6%；而蔗糖使菌株对荧蒽的降解率提高了11.5%，但抑制了对芘的降解；与之相反，果糖使菌株對芘的降解率提高了13.9%，抑制了对荧蒽的降解（图7）。因此，为了促进菌株CE3对荧蒽和芘的降解，可在降解体系中添加酵母提取物和蛋白胨，作为共代谢底物促进菌株CE3对荧蒽和芘的降解；如果只需降解荧蒽，可以选取蔗糖作为外源碳源物质促进降解；如果只需降解芘，则可选取果糖作为外源碳源物质促进降解。

3 讨论

本文从PAHs污染土壤中以荧蒽为唯一碳源分离到一株PAHs降解菌CE3，通过分子生物学方法鉴定，该菌为Azoarcus sp. CE3。虽然早先有报道Azoarcus属的菌能够厌氧降解含单个苯环的芳香烃和单个六元环结构如间二甲苯、二氧己烷等有机物^[11-13]，还有报道通过宏基因组测序发现一种能降解荧蒽和菲的混合菌中Azoarcus属细菌的含量高达58.5%^[14]，但本研究是首次分离到能降解PAHs的Azoarcus属菌株。CE3菌能以多种PAHs为唯一碳源进行生长，特别是能降解几种高分子量PAHs，说明CE3菌具有应用于环境PAHs污染治理的潜力。探究各种环境条件对菌株CE3降解荧蒽或芘的影响，发现菌株CE3能在较广的温度和pH范围降解荧蒽或芘；同时，添加酵母提取物、蔗糖和果糖可使CE3菌降解率提高。因此，菌株CE3在PAHs类污染物的修复中具有广阔的应用前景，本实验为CE3菌应用于环境PAHs污染治理及修复奠定了良好的基础。

由于目前仅完成实验室水平的液体体系降解测试，为实现CE3菌在PAHs污染土壤或水体中的应用，后期需要继续探究CE3菌在应用于环境治理时是否能保持其高效利用底物的特性，是否会与环境中原有的微生物群落相互作用等问题。

[ 参 考 文 献 ]

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Degradation Characteristics of Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons by Azoarcus sp. CE3

ZHANG Honghong¹， YE Chen¹， ZHANG Xiaoyun²， MENG Tian¹_，WANG Liming²， HUANG Yuping¹

（1 College of Life Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China;

2 Hubei Environmental Remediation & Governance

Techonlogical Research Co.， ltd.，Huangshi 435000，China）

Abstract：Microbial remediation has excellent characteristics in the control of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） pollution. In order to obtain microorganisms that can efficiently degrade PAHs， fluoranthene was used as the only carbon source to screen microorganisms. And then a high-efficiency degrading bacterium named CE3 was isolated. Strain CE3 was identified to belong to Azoarcus genus based on its 16S rDNA sequence analysis. To our knowledge， this is the first report that the strain of the Azoarcus genus has the ability to degrade high molecular weight PAHs. In addition to fluoranthene， strain CE3 also could degrade benzene， phenanthrene， pyrene， fluoranthene， benzo [a]anthracene， benzo [3，4]pyrene and benzo [b]fluoranthene. The degradation rates of fluoranthene and pyrene are more than 50% and higher than the degradation rates of other PAHs. Then， the degradation rates of fluoranthene and pyrene by strain CE3 under various conditions were analyzed in detail by HPLC method. The results showed that Azoarcus sp. CE3 could degrade fluoranthene or pyrene in a wide range of temperature and pH; moreover， the addition of yeast extract， sucrose and fructose to the medium could improve its degradation ability.

Keywords：polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）; fluoranthene; pyrene; degradation; Azoarcus

[責任编校：张 众]