不同产地乌药质量评价及其改善IBS-D 大鼠肠道低度炎症的机制研究

陈 镇，向 彪，周 鑫，付子煜，刘 涛，吴金鸿，欧阳林旗，喻 斌，邓桂明*

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

乌药为樟科山胡椒属植物乌药[Lindera aggregata (Sims) Kosterm.]的干燥块根，主产于浙江、湖南、广东等地，具有温肾散寒、行气止痛的功效。乌药主要化学成分为挥发油、生物碱、黄酮类、呋喃倍半萜及其内酯、鞣质等[1]。 现代药理学研究表明，乌药具有抗炎镇痛、抗肿瘤、保肝、降脂、降糖等药理活性，其对胃肠道疾病、心血管疾病、代谢综合征、脂肪肝等疾病具有显著的防治作用[1-4]。 课题组前期对乌药药理、药效作用进行了研究[4-6]，发现乌药水提物对腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D）大鼠腹痛、腹泻等症状具有显著改善作用。前期研究证实，乌药防治IBSD 大鼠疗效确切，但其作用机制仍有待进一步深入研究。

IBS-D 是一种非器质性病变的功能性胃肠道疾病，以持续或间歇性腹痛或腹部不适、排便频率、粪便性状改变等为主要特征[7]。IBS-D 发病机制尚未完全阐明，研究表明其与内脏高敏感性、胃肠动力异常、肠道菌群失调、免疫功能异常、肠道低度炎症等有关[8-9]。 为进一步开发乌药临床药用价值，本研究通过HPLC 方法对10 批不同产地乌药的质量进行分析和评价；同时，通过构建IBS-D 大鼠模型，进一步研究乌药对IBS-D 大鼠低度炎症的作用机制，以期为阐明乌药防治IBS-D 的作用机制研究提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF 级SD 大鼠60 只，体质量（200±20） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。 动物合格证号43004700022217，许可证号SCXK（湘）2017-0003。 饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，室温（23±2） ℃，相对湿度60%～70%，昼夜交替12 h/12 h。 大鼠适应性饲养一周后进行实验，动物实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心伦理委员会批准（伦理编号：ZYFY20170618-11）。

1.2 药材与试剂

番泻叶（批号2015112712）购自湖南三湘中药饮片有限公司；10 批次乌药购于湖南中医药大学第一附属医院和广州大参林药店，其来源信息分别为S1：批号20140227，郴州；S2：批号20160531，河北；S3：批号20150321，宁乡；S4：批号SL15090807，浙江；S5：批号20151028，湖南；S6：批号160406，浙江；S7：批号AM15032602，浙江；S8：批号HD16052602，湖南；S9：批号20150824，湖南；S10：批号160501，广州。上述中药材经湖南中医药大学第一附属医院张裕民教授分别鉴定为樟科植物乌药Lindera aggregata （Sims） Kosterm 的干燥块根和豆科植物番泻叶Cassia angustifolia Vahl 的干燥小叶，均符合《中华人民共和国药典》收载标准。 匹维溴铵片（批号639288，50 mg/片）购自Abbott Products SAS 公司。色谱级乙腈（批号：14094423，美国Merk 公司）；色谱级醋酸铵（批号：14091246，上海麦克林公司）；β-actin 抗 体（批号：AP0060）、YAP 抗 体 （批号：BZ00449）均购自美国Bioworld 公司；PPAR-γ 抗体（批号：sc-7273）、VCAM-1 抗体（批号：sc-6285）均购自美国SANTA CRUZ 公司；SRC 抗体（批号：11097-1-AP，美国Proteintech 公司）；超纯水由FLB00003057超纯水制备系统制得。

1.3 仪器

Agilent1290 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；5415R 型冷冻高速离心机（德国艾本德股份公司）；KQ5200D 型超声仪（东莞市科桥超声波设备有限公司）；BS124S 型十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；RE-5203 型旋转蒸发器（上海亚荣仪器厂）；DR-200Bs 型多功能酶标仪（Diatek 公司）；WD-9405A 型脱色摇床（北京市六一仪器厂）；A101439 型电泳仪、721BR12725 型凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad 公司；205A 型生物显微镜（中国Motic 公司）；KD-BM Ⅱ型生物组织包埋机（浙江省金华科迪仪器设备有限公司）；YD-A 型生物组织摊片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；Milli-Q 型超纯水净化系统（美国Billerica 公司）。

2 方法

2.1 乌药水提物供试品溶液制备

参考课题组前期文献制备方法[10]，将10 批不同产地的乌药制备成水提物，分别称取适量乌药，加入8 倍体积的水，浸泡30 min，武火加热至沸腾，煎煮1 h，滤取药物，药渣继续用6 倍水，武火加热至沸腾，煎煮1 h，滤取药物，合并续虑物，减压回收浓缩，使每毫升药物相当于1.0 g 生药，即为乌药水提物供试品溶液。

2.2 番泻叶水浸液制备

参考文献方法[11]，称取适量番泻叶，按照1∶4 的料液比加入沸水将番泻叶浸泡30 min 后，过滤；然后，再按照上述方法分别再浸泡3 次，过滤；合并前后4次滤液、混匀；将番泻叶水浸液减压浓缩至0.5 g·mL-1，4 ℃保存备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；温度25 ℃；流动相0.1 mol·L-1醋酸铵水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～30 min，2%～9% B；30～70 min，9%～12% B；70～80 min，12%～40% B；80～82 min，40% B；流速0.3 mL·min-1；进样体积10 μL；检测波长280 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 取样品S9 的供试品溶液，稀释50倍，离心30 min（12 000 r·min-1，4 ℃），用0.22 μm 微孔滤膜过滤于离心管中待测，按上述色谱条件重复进样6 次，计算得各主要峰的相对保留时间RSD 为1%以内，峰面积的RSD 均小于3.0%，符合指纹图谱的检测要求。

2.4.2 重复性 取样品S9 6 份，精密称定，按“2.1”方法制得供试品溶液，并稀释50 倍，精滤后在上述色谱条件下测定，各主要色谱峰相对保留时间的RSD为1%以内，峰面积的RSD 均小于3.0%，表明该方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性 取样品S9 1 份，按“2.1”方法制得供试品溶液，并稀释50 倍，精滤后按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、10 h 进样。各主要色谱峰的相对保留时间的RSD 为1%以内，峰面积的RSD 均小于3.0%，表明此样品溶液在10 h 内基本稳定。

2.5 造模、分组与给药

适应性饲养结束后，按照区组随机分组法将60只SD 大鼠分成对照组10 只，模型组50 只。采用“番泻叶灌胃联合束缚应激”的方法制备IBS-D 大鼠模型[12]：灌胃3.0 g·kg-1番泻叶水浸液，灌药1 h 后捆绑其前肢0.5 h，造模持续2 周。 将造模成功的50只大鼠随机分为IBS-D 模型组、乌药低剂量组、乌药中剂量组、乌药高剂量组和阳性药物组，每组各10 只。 乌药低、中、高剂量组大鼠分别给予0.94、1.88、3.76 g·kg-1乌药水提物灌胃，阳性药物组给予1.5 g·kg-1匹维溴铵水溶液灌胃，对照组和IBS-D模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，所有大鼠每日灌胃1 次，共持续2 周。

2.6 样本收集与处理

末次给药后，所有大鼠禁食不禁水24 h，麻醉，腹主动脉采血后处死。收集各组大鼠的结肠组织，生理盐水淋洗干净后，一部分浸泡于4%多聚甲醛中备用，另外一部分分装好迅速转移至-80 ℃冰箱备用。

2.7 HE 染色观察结肠组织形态

取大鼠结肠组织于4%多聚甲醛中固定，切成约0.2 cm 厚的组织块，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明。 浸蜡：48～52 ℃软蜡30 min，58～62 ℃硬蜡60 min；包埋：自然冷却后修整蜡块置低温保存备用；切片：厚度约5 μm，摊片，捞片，60 ℃温箱中烘烤；染色。二甲苯中透明5 min，中性树胶封片，常温晾干。

2.8 PAS 染色观察结肠组织杯状细胞形态及数量变化

切片、脱蜡后，于N-HCl 液内室温浸洗1 min。再转入已预热到60 ℃的N-HCl 液内8 min。 水解后在N-HCl 液室温浸洗1 min。 在临用时新配的亚硫酸溶液内洗3 次，每次2 min。流水冲洗5 min，蒸馏水洗。复染于1%光绿水溶液2 min，复染后水洗。脱水，透明，封片。 最后，根据Kruschewski 法进行组织学指数评分，观察各组大鼠结肠隐窝上的杯状细胞数量的变化。

2.9 免疫组织化学检测YAP、PPAR-γ、SRC、VCAM-1蛋白表达水平

切片、脱蜡后，3%过氧化氢浸泡10 min，蒸馏水洗，PBS 洗2 次，每次3 min。 抗原修复1 次：把切片浸泡在PBS 中，微波炉加热沸腾即可。隔水冷却至常温，PBS 洗2 次，每次3 min。 37 ℃恒温箱中孵育β-actin 抗体2 h，PBS 洗3 次，每次2 min。 使用中杉金桥PV9000 二抗试剂盒，滴加试剂1，室温20 min，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加试剂2，室温30 min，PBS 洗3 次，每次2 min；加DAB 显色，显微镜下观察显色结果，自来水终止反应。 苏木素复染3 min，水洗，盐酸乙醇分色，自来水中促蓝。 脱水、透明，中性树胶封片，常温晾干。

2.10 Western blot 检测YAP、SRC 蛋白表达水平

适量结肠组织块研碎，加入适量裂解液冰上放置20 min，使用超声破碎仪粉碎20 s，于4 ℃，15 000 r/min 离心10 min，取上清液测量蛋白浓度，酶标仪检测各个样品562 nm 波长的吸光度值。分别配制10%分离胶及5%浓缩胶，每孔上样本蛋白40 μg。 80 V 浓缩胶中电泳30 min，120 V 分离胶中电泳约90 min，溴酚兰距玻璃板5 mm 左右终止电泳，并以4 ℃，100 V 湿转1.5 h 后，将PVDF膜取出置TBST 配制的5%脱脂牛奶封闭1 h。 PVDF膜和β-actin 抗体（1∶5 000）放入抗体孵育盒，4 ℃过夜。TBST 缓冲液洗膜3 次，37 ℃孵育山羊抗兔二抗1 h，TBST 缓冲液洗膜3 次。 凝胶成像软件显影、定量并计算目标蛋白的相对表达量。

2.11 统计分析

使用SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析，数据用“±s”表示。若满足正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐用LSD，方差不齐用Dunnet T3 分析；若不满足正态性检验，多组间比较采用秩和检验；组间比较采用独立样本t 检验；P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HPLC 结果

按照“2.1”制备S1-S10 号供试品溶液，并稀释50 倍，精滤后再按上述色谱条件进行检测。将10 批乌药样品的HPLC 图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 版本）”软件，并生成指纹图谱，设置S5 为参照图谱，对色谱峰多点校正后进行全谱峰匹配后标定了14 个共有峰。

3.2 相似度评价

选择10 批乌药样品中色谱峰峰型、分离度良好且基线平整的S5 样品色谱图作为参照指纹图谱。对色谱峰多点校正后进行全谱峰匹配，用中位数法生成对照图谱。 结果显示，S6 的相似度为0.868，而其余9 批乌药样品相似度均大于0.950。浙江乌药相似度较其他产地乌药低，表明它们在化学成分组成上存在一定的差异。

3.3 聚类分析和主成分分析

10 批乌药的HPLC 指纹图谱中共有14 个共有峰（见表1、图1），将14 个共有峰的相对峰面积数据进行聚类分析和主成分分析（见图2）。 结果显示，样品S6 偏离原点较远，自成一类；而其余批次，不同产地的乌药聚集成同一类。由此说明，浙江乌药与其余批次乌药在化学成分组成上具有较大的差异，而湖南、河北、广东乌药在化学组成上差异不大。 上述分析结果与相似度结果一致，说明乌药饮片质量相对稳定。 基于上述实验结果，本文选取产于湖南的乌药（批号20150824）作为被试药材水提物对IBS-D大鼠进行干预治疗。

表1 10 批乌药14 个共有峰的峰面积

图1 10 批不同产地乌药水提物的HPLC 图谱

图2 聚类分析结果和主成分分析

3.4 乌药水提物对IBS-D 大鼠结肠组织形态及杯状细胞的影响

HE 染色结果显示，与对照组相比，模型组可见炎性细胞浸润，但未见充血、坏死、溃疡等情况。 用IPP6.0 软件分析结肠隐窝深度，并根据Kruschewski法进行组织学指数评分。与对照组相比，模型组中隐窝深度显著变浅；与模型组相比，乌药水提物低、中、高剂量组和阳性药物组中隐窝深度显著加深（图3A、B）。 PSA 染色结果（图3A、C）显示，IBS-D 模型组大鼠结肠组织隐窝杯状细胞数目显著少于对照组（P＜0.01），而在中、高剂量的乌药水提物和阳性药物干预下，IBS-D 大鼠隐窝杯状细胞显著增加（P＜0.05）。上述研究结果表明，采用“番泻叶灌胃联合束缚应激”造模方法可成功制备IBS-D 大鼠模型；乌药水提物能显著改善IBS-D 大鼠肠道低度炎症的症状。

图3 乌药水提物对IBS-D 大鼠结肠组织形态及杯状细胞的影响

3.5 乌药水提物对IBS-D 大鼠PPAR-γ/VCAM-1及SRC/YAP 通路的影响

免疫组化结果显示，模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞中YAP、PPAR-γ 和SRC 的平均光密度显著低于对照组（P＜0.01），VCAM-1 显著高于对照组（P＜0.01）。与IBS-D 模型组相比，乌药低、中、高剂量组和阳性药物组大鼠结肠黏膜上皮细胞中YAP、PPAR-γ 和SRC 的平均光密度显著升高（P＜0.05），VCAM-1 显著降低（P＜0.05）。 详见图4。

图4 乌药水提物对IBS-D 大鼠结肠组织YAP、PPAR-γ、SRC 和VCAM-1 表达的影响

Western blot 结果显示与免疫组化一致。 与对照组相比，模型组YAP 和SRC 蛋白相对表达量显著低于对照组（P＜0.01）。与模型组相比，乌药水提物低、中、高剂量组和阳性药物组蛋白相对表达量显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。 详见图5。

图5 乌药水提物对IBS-D 大鼠结肠组织YAP、PPAR-γ、SRC 和VCAM-1 蛋白表达的影响

4 讨论

本研究基于HPLC 法对湖南、河北和浙江等省10 批乌药进行分析、检测，通过建立特征图谱，标定出14 个共有峰。 方法学考察结果表明，该分析方法稳定可靠、重现性较好。相似度分析结果显示，10 批乌药样品与对照指纹图谱相似度为0.868～1.0，其中湖南、河北、广东产乌药与对照指纹图谱相似度较高（0.950～1.0），浙江产乌药与对照指纹图谱相似度较低（0.868～0.950）。 通过聚类分析和主成分分析，可将10 批乌药分为浙江乌药与其他产地乌药两类。聚类分析结果显示，湖南、河北、广东等不同地区的乌药聚为一类。由此可见，中药材乌药具有一定的产地适应性，各产地乌药质量基本稳定、可控。

Hippo 信号通路是一条能够调控细胞分裂、增殖、分化和凋亡的信号通路，YAP 是该通路上的一个效应因子，具有启动Hippo 通路基因转录、翻译的能力[13]。Hippo 信号通路与器官发育、细胞增殖分化、免疫调节等生理活动密切相关。 研究发现，Hippo 信号通路上的关键激酶YAP 在LGR5+肠道干细胞增殖分化，维持肠道干细胞稳态的生理过程中扮演着重要角色[14]。 LGR5+肠道干细胞是一类特异性表达LGR5、具有持续增殖分化功能的细胞，当LGR5+肠道干细胞增殖分化失衡或功能缺失可造成机体肠上皮修复障碍，从而诱发炎症性肠病、结直肠癌等一系列肠道疾病[15]。 FALLAH S 等[16]研究发现，YAP 能够抑制杯状细胞、吸收性细胞等肠上皮细胞分化，该抑制作用与SRC 家族激酶对Hippo 通路介导有关。 此外，TANIGUCHI K 等[17]研究发现，增强YAP 和SRC蛋白表达能够促进炎症破坏后的肠道修复。 由此提示，Hippo/YAP/SRC 信号通路对修复肠道的破坏及改善肠道低度炎症症状具有重要意义。

PPAR-γ 为核受体超家族成员可在血管平滑肌、内皮细胞、巨噬细胞中表达[18]。 PPAR-γ 在炎症因子刺激下，其相对表达量会降低[19]。此外，PPAR-γ可调节VCAM-1、ICAM-1 等细胞黏附分子和其他炎症介质的分泌和释放，从而对炎症反应起到一种负调控作用[20]。研究表明，PPAR-γ 与NF-κB 之间存在一种双向拮抗作用[21]。 PPAR-γ 低表达会削弱了其对NF-κB 信号通路的抑制作用，从而增强VCAM-1蛋白表达，导致肠道炎症的发生、发展[22]。

课题组前期基于网络药理学研究发现，乌药对Hippo/YAP 和PPAR-γ 信号通路具有调节作用[6]。因此，本文在前期研究基础上，采用“番泻叶灌胃联合束缚应激”的方法制备IBS-D 大鼠模型，进一步探讨乌药对IBS-D 大鼠的作用机制。 HE 和PAS 染色结果表明，IBS-D 大鼠肠道存在低度炎症，而乌药水提物能显著改善IBS-D 大鼠肠道低度炎症的症状。免疫组织化学和Western blot 研究结果表明，乌药水提物能够增强YAP 和SRC 蛋白表达。由此提示，乌药水提物可能是通过增强YAP 和SRC 蛋白表达，抑制杯状细胞分化，促进肠道炎症的修复，最终改善IBS-D 大鼠肠道低度炎症症状。此外，免疫组织化学结果显示，IBS-D 大鼠结肠黏膜上皮细胞中PPAR-γ平均光密度显著减少，VCAM-1 平均光密度显著增加；而乌药水提物能够显著升高IBS-D 大鼠结肠黏膜上皮细胞中PPAR-γ 光密度，显著降低VCAM-1光密度。 由此提示，乌药水提物还可能通过PPARγ/VCAM-1 通路改善IBS-D 大鼠肠道炎症症状。

综上所述，本文通过HPLC 技术对不同产地的乌药进行质量评价，证实被试的不同批次乌药质量稳定、可靠。 此外，研究发现乌药治疗IBS-D 大鼠低度炎症的作用机制可能与PPAR-γ/VCAM-1 信号通路有关。