降气平喘汤对哮喘大鼠气道重塑相关炎症因子及ADAM33、ETS-1 表达的影响

朱沁泉，张 涤*

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

支气管哮喘（简称哮喘）是小儿常见的肺部疾患，主要表现为反复发作性咳嗽、喘息、气促、胸闷，并伴可逆性的气道高反应及梗阻性呼吸道疾病[1]。哮喘是由环境因素与遗传因素共同决定的多基因复杂性疾病，遗传因素决定了个体对哮喘的易感性，其主要发病机制是Th 淋巴细胞失衡、气道炎症、气道重塑和信号通路调节异常[2]。 气道炎症、组织结构损伤以及继发性组织异常修复导致哮喘患者气道壁结构改变称为气道重塑，是哮喘的主要病理特征[3]。

现代医学治疗小儿哮喘主要以激素类药物内服或雾化为主，由于儿童对药物的新陈代谢水平与成人不同，儿童长期使用糖皮质激素类药物具有一定的风险。目前，已有研究证实应用中医药干预可改善气道重塑、降低易感基因表达，可有效治疗哮喘[4-6]。湖南省名中医张涤从事中医药防治儿童呼吸系统疾病的临床工作近30 年，结合哮喘“痰气搏结”的病机原理，创立降气平喘汤治疗儿童哮喘急性发作期。研究显示，降气平喘汤可明显缓解哮喘急性发作期患儿临床症状，减少急性发病次数及病情程度[7-8]。

本研究通过构建哮喘大鼠模型，观察哮喘大鼠肺组织中炎症因子及解整合素金属蛋白酶33（ADAM33）、E26 转录因子-1（E26 transformation-specific, ETS-1）表达的情况，探究降气平喘汤改善哮喘气道重塑的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级健康雄性SD 大鼠60 只，鼠龄6 周，体质量（200±20） g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。实验地点：湖南中医药大学第一附属医院。 本实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（备案编号：ZYFY20210408），符合实验动物福利与伦理原则。

1.2 药物及主要试剂

降气平喘汤（蜜麻黄1 g，桔梗3 g，苦杏仁3 g，桑白皮5 g，地骨皮5 g，白果2 g，紫苏子2 g，葶苈子2 g，白前3 g，百部3 g，款冬花3 g，紫菀3 g，甘草2 g），所有中药材均购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经浸泡、煎煮、旋转蒸发浓缩至生药量为0.806 g/mL 的药液，置于4 ℃冰箱中保存。孟鲁司特钠片（杭州默沙东药业股份有限公司，规格：5 mg/片，批号：J20130054）为本实验阳性对照组用药，给药前将孟鲁司特钠片剂磨碎，用生理盐水配制成含药量为0.26 mg/mL 药液。

卵蛋白（ovalbumin, OVA）（美国Sigma 公司，批号：A5253）；大鼠白细胞介素-1β(interleukin 1 beta,IL-1β）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R0012c），大鼠白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R0015c），大鼠转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-0162c），均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；PierceTM Rapid Gold BCA 蛋白测定试剂盒（北京兰杰柯科技有限公司，批号：69107317）；5×蛋白上样缓冲液（武汉四维加生物科技有限公司，批号：8190011128）；TRIS（批号：115KG001-1KG），甘氨酸（批号：1275KG2P5-2.5KG）均购自广州赛国生物科技有限公司；SDS（批号：#S8010-500 g），Tween 20（批号：#T8220）均购自北京索莱宝科技有限公司；ECL 化学发光底物（美国Bio-Rad 公司，批号：170-5060）；蛋白Marker（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号：26616）；RNA 提取液（批号：G3013），ServicebioR○RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批号：G3330），2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（批号：G3320）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（美国HyClone 公司，批号：SH30538.02）。

1.3 主要仪器

电热恒温培养箱（日本Asone 公司，型号：ICV-450）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司，型号：FlexStation 3）；组织研磨器（上海净信实业发展有限公司，型号：Tissulyser-24）；电泳槽（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-6C）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司， 型号：Rt-6100）；暗匣（广东粤华医疗器械厂有限公司，型号：AX-Ⅱ）；荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司，型号：CFX）；超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop2000）；光学显微镜（日本尼康公司，型号：Eclipse E100）；成像系统（日本尼康，型号：DS-U3）。

2 方法

2.1 分组

60 只大鼠随机选取15 只为正常组，其余大鼠造模，造模成功大鼠，随机分为模型组、中药组和西药组，每组15 只。

2.2 模型制备与干预

除正常组外，其余大鼠均参照文献[9-10]并加以改进制备哮喘模型，分别于第0、7 天给大鼠腹腔注射0.2 mL OVA 致敏液，第14 天将大鼠放入雾化器的有机玻璃盒中，以2.5%OVA 液雾化吸入激发30 min，每天1 次，连续雾化14 d。 在第31、34、37、40、44、47、50、53 天以同样方法雾化激发，共激发22次。 正常组以生理盐水雾化。 激发时，观察大鼠反应，若出现咳嗽、呼吸加深加快、耸毛、喷嚏、干呕、抓耳挠腮、烦躁不安等症状中的2 项或2 项以上者，或抽搐、虚脱者，即为造模成功。 剔除造模失败大鼠，每组保留12 只进行后续实验研究。

按照人与大鼠体表面积换算公式计算给药剂量[11]，中药组大鼠每天降气平喘汤灌胃生药量为8.06 g/kg，西药组大鼠每日孟鲁司特钠灌胃给药剂量为2.6 mg/kg。 从实验第54 天开始，每天灌胃1次，中药组予降气平喘汤，西药组予孟鲁司特钠，正常组和模型组予生理盐水，给药剂量均为10 mL/kg，连续7 d。 各组于末次给药后禁食12 h，次日处死大鼠，取肺组织进行相关指标检测。

2.3 标本制备

用戊巴比妥麻醉大鼠，处死后，开胸摘取肺组织，用预冷的PBS 冲洗。 取部分右肺，浸入10%中性福尔马林固定液中固定，石蜡包埋，切片行HE 染色，余肺上叶用于ELISA 检测，中叶和下叶用滤纸吸干后放于冻存管，置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

2.4 指标检测

2.4.1 HE 染色观察肺组织病理变化 先将肺组织切片脱蜡至水，依次进行苏木精染色、伊红染色、脱水封片，在显微镜下观察拍照。选择视野主要观察肺叶、气道及伴行血管、肺泡等结构的形态，有无炎症浸润及气道重塑等。

2.4.2 ELISA 法检测肺组织IL-1β、IL-6、TGF-β1浓度 肺组织称重后剪碎，将剪碎的组织与PBS 加入组织研磨器中，充分冰浴研磨，匀浆液3 000 r/min离心10 min，取上清液检测。 严格按照ELISA 试剂盒说明书检测上清液IL-1β、IL-6、TGF-β1 浓度。

2.4.3 Western blot 法检测肺组织ADAM33、ETS-1蛋白的表达 提取各组肺组织蛋白，匀浆后用BCA法测定蛋白浓度。 10%的分离胶、5%的浓缩胶对各组蛋白样品进行电泳分离、转膜、封闭，PVDF 膜与一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜5 min×5次，室温下将PVDF 膜二抗中孵育60 min，TBST 洗膜5 min×5次后，滴加新鲜配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面侧，发光检测。 将胶片扫描存档，AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标带的光密度值。

2.4.4 real-time PCR 法检测肺组织ADAM33 mRNA 的表达 按照试剂盒要求抽提大鼠右肺下叶肺组织的总RNA，用蛋白核酸分析仪检测RNA 浓度后，按照试剂盒说明书将总RNA 反转录成cDNA，2×SYBR GREEN 实时荧光定量PCR 检测肺组织ADAM33 mRNA 表达情况。 real-time PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 个循环。 同时每升温0.5 ℃，采集1 次荧光信号，绘制熔解曲线。 引物序列为（232bp）：上游5'-GGCACTGTCAGAATGCTACCTCC-3'，下游5'-CCAGGAAGTAGAGGCAGCAGAAA-3'。 采用2-△△ct方法对实验数据进行处理。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 造模情况

正常组大鼠反应灵敏，行动敏捷，无呼吸肌痉挛表现。 模型组大鼠在激发时出现呼吸急促甚至困难、轻度发绀、腹肌紧张、抓鼻等症状，多次激发后出现反应迟钝、行动迟滞甚至仆卧不动、皮毛无光泽、体质量增长缓慢。 西药组、中药组大鼠给药前症状与模型组相似，给药后气促、打喷嚏等症状有不同程度的改善。

3.2 各组肺组织病理变化

正常组肺组织内气道黏膜上皮和肺泡结构完整，无充血或水肿，肺组织无明显异常炎症反应，气道平滑肌平缓而薄，偶有少量炎症细胞浸润，肺泡间隔距离较窄。 模型组肺小叶结构破环，肺泡结构紊乱融合，黏膜充血水肿，肺组织的气道腔、气管壁及伴行的血管周围有大量淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞及大量黏性分泌物，气道、肺泡上皮损伤脱落、气道平滑肌层和网状基底膜层增生，气道黏膜襞增多、气道壁明显增厚。 西药组采用孟鲁司特钠处理后，大鼠肺部炎症较模型组相对减轻，肺叶结构仍不完整，仍可见肺组织的气道腔、气管壁及伴行的血管周围中等量的炎症细胞浸润，平滑肌层厚度轻度增生，纤维结缔组织增生减少。 中药组经降气平喘汤处理后，大鼠肺部炎症较模型组程度减轻，支气管腔的部位仅有少量散在的炎症细胞浸润，平滑肌层厚度基本正常，纤维结缔组织接近正常组。 详见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色结果（×400）

3.3 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TGF-β1 浓度比较

与正常组比较，模型组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TGF-β1 浓度明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组及中药组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TGFβ1 浓度明显降低（P＜0.05）；与西药组比较，中药组大鼠肺组织中IL-1β 浓度降低（P＜0.05），IL-6、TGFβ1 浓度升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表1。

表1 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TGF-β1 浓度比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TGF-β1 浓度比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组n 12 12 12 12 IL-1β/（pg·mL-1）2 383.97±513.59 3 814.85±381.89#3 346.90±521.92*3 185.10±1 129.83*△IL-6/（pg·mL-1）136.80±16.72 209.02±26.23#158.84±21.09*179.84±16.86*TGF-β1/（ng·mL-1）1.84±0.15 2.42±0.26#2.16±0.14*2.28±0.23*

3.4 各组大鼠肺组织ADAM33、ETS-1 蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组大鼠肺组织ADAM33、ETS-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中药组大鼠肺组织ADAM33、ETS-1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与西药组比较，中药组大鼠ADAM33 蛋白表达水平略降低，ETS-1 蛋白表达水平略升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2、图2。

表2 各组大鼠肺组织ADAM33、Est-1 蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织ADAM33、Est-1 蛋白表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组n 12 12 12 12 ADAM33/β-actin 0.51±0.06 1.00±0.09#0.34±0.02*0.29±0.03*ETS-1/β-actin 0.74±0.18 0.95±0.14#0.37±0.10*0.43±0.07*

图2 各组大鼠肺组织AMAD33、ETS-1 蛋白表达电泳图

3.5 各组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量比较

与正常组比较，模型组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中药组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量明显降低（P＜0.05）；与西药组比较，中药组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量明显降低（P＜0.05）。 详见表3。

表3 各组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织ADAM33 mRNA 相对表达量比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。

ADAM33 mRNA 相对表达量0.80±0.26 4.05±0.36#2.81±0.19*1.91±0.13*△组别正常组模型组西药组中药组n 12 12 12 12

4 讨论

哮喘是气道炎症、气道重塑、气道高反应性及遗传因素共同作用的结果，气道重塑的特征之一是气道平滑肌增厚，是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）分子的过度产生和堆积导致的病理改变[12]。IL-1β 和IL-6 作为常见的促炎因子，前者主要由单核-巨噬细胞产生，可上调黏蛋白MUA5AC 表达，促使黏液分泌[13]；后者来源于体内内皮细胞、单核细胞等，可介导多种炎症因子浸润于支气管黏膜[14]，二者都能促进气道平滑肌细胞增生，使气道平滑肌增厚。TGF-β1 由体内多种细胞分泌，可使炎症因子在气道内聚集和大量释放，推动成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并可能引起气道平滑肌的上皮下纤维化和增殖[15]。研究表明，ADAM33 在气道平滑肌与成纤维细胞中均有表达，通过水解细胞表面的黏附分子，释放表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epithelial growth factor, HB-EGF）等生长因子，导致气道平滑肌与成纤维细胞过度增殖，诱发气道重塑[16-17]。 研究证实，ADAM33 过表达与哮喘发病密切相关，与儿童哮喘的早期起源、气道高反应性及小气道重塑密切相关[18]。 ETS-1 能够调控许多哮喘相关的细胞因子和趋化因子的表达，如IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β 等，进而参与哮喘的发病过程，同时在气道重塑中发挥重要作用[19]。

小儿哮喘发病常因外感风寒之邪，又因小儿肺常不足，表邪未散，入里化热，形成寒热夹杂之候。小儿易感外邪，多随风而入，感邪之后易从热化，或宿根痰饮内伏，积久化热，痰热壅塞气道。 结合湖南省地理位置、气候特点，及小儿饮食生活习惯，张涤教授在治疗上遵从“因时制宜，因地制宜，因人制宜”的思想，将患儿的疾病、饮食习惯、体质状态、气候环境等与辨证论治思想相结合，临床用自拟降气平喘汤治疗小儿哮喘急性发作期外寒肺热证[7]。 降气平喘汤据《摄生众妙方》中的定喘汤化裁而来，其药物组成为蜜麻黄、桔梗、苦杏仁、桑白皮、地骨皮、白果、紫苏子、葶苈子、白前、百部、款冬花、紫菀、甘草等。 蜜麻黄宣肺散邪平喘，又能解外感风寒之证，白果敛肺定喘祛痰，共为君药，一散一收，既加强平喘之功，又防麻黄耗散肺气；苦杏仁以降为主、润燥下气为臣药；桑白皮清泻肺热、止咳平喘，地骨皮泻肺火、退虚热，两药入肺经共解肺热；紫苏子、葶苈子降气平喘；桔梗为舟楫之剂载药上行为佐使，与苦杏仁一升一降顺畅气机。佐白前、百部、款冬花、紫菀润肺化痰止咳；甘草调和诸药为使。诸药合用，表寒得解，肺热清泄，共奏降气平喘，止咳化痰之功，则肺气宣降得当、痰热得化，咳喘得止。孟鲁司特钠是白三烯受体拮抗剂，通过竞争性结合半胱酸受体，抑制白三烯的活性，发挥舒张支气管平滑肌、减轻黏膜炎症细胞浸润、降低气道高反应性的作用[20]，具有良好的抗炎和降低气道阻塞的作用[21]，研究发现孟鲁司特钠可降低气道平滑肌细胞上清液中TGF-β1 和IL-6 水平[22]，同时抑制气道平滑肌细胞增殖、改善气道重塑、减轻炎症反应[23]。

本研究结果显示，降气平喘汤可明显减轻哮喘模型大鼠肺部炎症程度，降低支气管腔炎症细胞浸润情况，抑制平滑肌肌层厚度及纤维结缔组织改变，证明降气平喘汤对哮喘模型大鼠气道炎症及气道重塑的抑制作用。 降气平喘汤可降低哮喘模型大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TGF-β1 等炎症因子浓度，下调ADAM33、ETS-1 的蛋白表达水平，与孟鲁司特钠组无显著差异。本研究尚缺乏对降气平喘汤缓解气道炎症与抑制哮喘易感基因表达之间的机制研究，有待进一步探索。

综上所述，降气平喘汤抑制气道重塑的机制与减少IL-1β、IL-6、TGF-β1 等炎症因子释放及抑制ADAM33、ETS-1 表达相关，为降气平喘汤治疗哮喘的推广使用提供了理论支撑。