宏基因组二代测序对下呼吸道感染诊断治疗的价值研究

刘莉琼 刘露 黄晖 徐艳 万敏娜

（江西省宜春市人民医院1.呼吸内科；2.全科医学科，宜春 336000）

呼吸系统感染是临床常见疾病，实验室检测对呼吸系统感染性疾病的及时诊断和治疗方案的完善有着重要意义[1]。传统检测方法存在敏感性低、特异性差等方面的不足，而且对于罕见病原微生物等不能够快速识别，影响诊断结果，延误临床治疗[2]。随着研究进展，宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）应用于疾病的诊断，能够更为快速、准确得对下呼吸道感染进行诊断，便于临床及时进行目标抗感染治疗[3]。本院开展了这方面的研究，效果较好。汇报如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

招募2019年11月至2022年11月江西省宜春市人民医院接诊的100例疑似下呼吸道感染患者。纳入标准：①有疑似下呼吸道感染相关症状；②同意行纤维支气管镜检查及肺泡灌洗并将支气管肺泡灌洗液（bronchocalveolar lavage fluid，BALF）进行mNGS检测；③均签署知情同意协议书。将患者按随机数字表法进行分组，每组50例。A组男女34∶16，年龄为20~78岁，平均（51.24±7.58）岁；B组男女33∶17，年龄为21~78岁，平均（52.16±7.96）岁。两组上述基本资料差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准。排除：①有精神疾病或认知交流障碍者；②无配对的传统培养者；③不能耐受纤维支气管镜检查者；④mNGS样本未通过质量控制者；⑤重要数据遗失者。剔除：①病例纳入后，因各种原因各个环节，发现不符合入选标准者；②患者依从性差，特殊生理变化，不适宜继续接受随访观察者。

1.2 方法

A组接受mNGS及常规培养、细菌、真菌涂片或PCR等传统检测。B组接受常规培养、细菌、真菌涂片或PCR等传统检测。患者入院后根据病情予抗感染、营养支持等对症治疗，根据检测结果及时调整治疗方案。

BALF的收集根据支气管肺泡灌洗术操作规范进行[4]。合格的BALF根据《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》[5]行mNGS检测：①样本灭活处理后提取核酸；②通过DNA片段化、修复末端、测序接头连接以及PCR扩增等步骤制备文库，然后上机进行高通量测序；③对数据进行质量控制[读长50 bp以上检出序列数（reads）及20 M以上测序数据量]及数据过滤（去除宿主人源序列），与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的微生物数据库进行比对分析；④报告应包括检测出的所有病原微生物（10 bp以上的匹配独特读长及＞1%的数据库总数比例）及其分类、检测内容、检测方法、检测结果说明及附录；⑤临床医生通过综合检测结果及临床特征，并结合《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》[6]进行判断。

1.3 观察指标

①比较两组检测耗时，并以临床最终诊断为金标准，比较两组对下呼吸道感染的诊断价值（灵敏度、特异度、准确度）。②每日1次，持续评定或检测患者急性生理与慢性健康评分Ⅱ（acute physiology and chronic health e-valuationⅡ，APACHE Ⅱ）[7]、白细胞（white blood cell，WBC）、降钙素原（proealcitonin，PCT）及C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。③根据卫生部《抗菌药物临床研究指导原则》[8]评价临床疗效。痊愈：临床症状、体征、实验室检查及细菌学检查指标均恢复正常；显效：病情明显好转，但上述四项中1项未完全恢复；有效：病情有一定好转，上述四项中2项或2项以上未完全恢复；无效：病情无好转或加重，甚至死亡。总有效率=（痊愈例数+显效例数+有效例数）÷总例数×100%。④观察两组体温、啰音、CRP、WBC、胸片检查改善时间。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件，计量资料以均数土标准差（±s）表示，计量资料符合正态分布比较采用两个独立样本t检验，符合偏态分布比较采用秩和检验；计数资料以例数或率表示，根据样本条件分别采用χ2检验、McNemar检验或Fisher精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组检测耗时及诊断价值比较

A组经临床最终诊断确诊43例为下呼吸道感染；B组经临床最终诊断确诊41例为下呼吸道感染。A组检测耗时短于B组（P＜0.05），对下呼吸道感染诊断的灵敏度、特异度及准确度均高于B组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组检测耗时及诊断价值比较

2.2 两组APACHE Ⅱ评分、WBC、PCT及CRP水平比较

治疗前，两组APACHE Ⅱ评分、WBC、PCT及CRP水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组APACHE Ⅱ评分、WBC、PCT及CRP水平均低于治疗前，且A组低于B组（P＜0.05），见表2。

表2 两组APACHE Ⅱ评分、WBC、PCT及CRP水平比较（±s）

表2 两组APACHE Ⅱ评分、WBC、PCT及CRP水平比较（±s）

分组APACHE II评分/分WBC/（×109/L）PCT/（ng/mL）CRP/（mg/L）治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后A组（n=43）21.14±3.4810.24±1.4620.22±2.318.18±1.040.87±0.090.39±0.074.78±0.981.77±0.26 B组（n=41）21.23±3.5715.77±2.4820.33±3.1414.27±1.380.89±0.110.61±0.094.81±1.212.59±0.32 t值0.17024.8370.31238.3991.45720.6090.20120.681 P值＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.3 两组疗效比较

A组治疗总有效率为100.00%，高于B组的85.37%（P＜0.05），见表3。

表3 两组疗效比较[n（%）]

2.4 两组体温、啰音、CRP、WBC、胸片检查改善时间比较

A组体温、啰音、CRP、WBC、胸片检查改善时间均早于B组（P＜0.05），见表4。

表4 两组体温、啰音、CRP、WBC、胸片检查改善时间比较（±s，d）

表4 两组体温、啰音、CRP、WBC、胸片检查改善时间比较（±s，d）

分组体温改善时间啰音改善时间CRP改善时间WBC改善时间胸片检查改善时间A组（n=43）1.98±0.642.87±0.773.02±0.753.11±0.814.22±0.94 B组（n=41）2.87±0.974.02±0.944.88±0.875.12±0.926.12±1.03 t值9.1199.79416.26216.27213.254 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

3 讨论

下呼吸道感染是常见的呼吸系统疾病，包括急性气管-支气管炎、肺炎、慢性支气管炎急性加重、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张等多种类型[9]。临床上以发热、咳嗽、咳痰等为主要症状，严重者可出现气短、胸闷、呼吸衰竭甚至死亡。下呼吸道感染可由多重病原体引起，主要包括细菌、病毒、真菌、肺炎支原体、衣原体等多种病原微生物，特别是在免疫力低下的人群中，容易并发多重病原体感染[10-11]。因此，快速微生物学诊断对于提高肺部感染的治愈率、降低死亡率显得尤为重要。但目前的检测方法只能识别出30%~40%肺部感染性疾病患者的病原体[12]。病原体确诊的延迟通常会迫使医生开出经验性的广谱抗生素处方，大大增加抗生素的滥用以及多重耐药菌的风险，并可能增加严重感染患者的死亡率。

由于抗生素的不合理使用等因素，病原微生物种类呈多样化、复杂化，下呼吸道感染性疾病的诊疗难度越来越大，这对临床上病原微生物的诊断方法提出了更高的要求和挑战[13]。传统的病原体检测技术主要是基于病原微生物培养和分离，方法包括传统微生物培养技术、免疫学方法、PCR等，在病原体检验及鉴定中具有不可替代的地位。但传统病原体检测受多种因素影响，有阳性率低、耗时长、对检测人员水平要求高等缺陷，且预防性或经验性抗生素的使用可能会阻碍实验室培养结果，生长缓慢的病原体也在一定程度上限制了实验室培养的敏感性[14]。因此，目前迫切需要一种更灵敏、准确的微生物诊断方法来弥补传统实验室检测方式的缺陷。

mNGS作为一种新型DNA/RNA测序方法，其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列，可以同时测定几百万甚至上亿条DNA或者RNA序列[15-16]。mNGS以其高通量、短耗时、无偏倚的特点在临床工作中已逐渐得到认可，它不仅可用于多种病原体的检测，也可用于多种标本的检测，如痰液、血液、脑脊液、肺泡灌洗液、组织等[17-18]。本研究结果显示，A组检测耗时短于B组（P＜0.05）。A组对下呼吸道感染诊断的灵敏度、特异度及准确度均高于B组（P＜0.05），说明mNGS对于下呼吸道感染的病原学诊断价值更高。A组治疗后APACHE Ⅱ评分、WBC等感染指标均低于B组（P＜0.05），体温等症状改善时间均早于B组（P＜0.05），治疗总有效率高于B组（P＜0.05），提示患者经积极诊断，能更及时改善诊疗方案，使得患者获得更为专业的治疗，预后得到明显提高。mNGS检测方法虽好，但依然存在一定的漏诊率。其原因可能受数据库完整性的影响，或者缺少基因数据库，使得诊断效果受到影响。而且样本前处理存在的污染可能也会影响结果。RNA的易降解性也使得检测难度增加。还需进一步提高mNGS的检测设备、技术等，以提高诊断准确性，更好地辅助临床诊治。

总之，mNGS对下呼吸道感染诊断的价值较好，可以辅助临床诊治，值得临床推荐。