基于网络药理学与分子对接的丹皮酚治疗结直肠癌的分子机制研究

高吴陆怡，王静艳，2，舒岑皓，尚德淑，韩锁，商宇

（1.佳木斯大学基础医学院微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院康复医学科，黑龙江 佳木斯 154003；3.中国医科大学生命科学学院发育细胞生物学教研室，教育部医学细胞生物学重点实验室，沈阳 110122；4.哈尔滨医科大学附属第四医院中心导管室，哈尔滨 150001）

结直肠癌 （colorectal cancer，CRC） 是消化系统常见的癌症类型之一。根据国际癌症研究机构的统计结果，2020年全球CRC发病人数约为190万，死亡人数约为93.5万，其发病率和死亡率均居于全球前三位［1］。CRC的发病具有隐匿性，而中晚期CRC的手术与常规辅助治疗往往无法获得理想的治疗效果［2］。因此，探索新的有效的CRC辅助治疗手段具有重大意义。

丹皮酚又名牡丹酚、芍药醇，是中药牡丹皮和徐长卿的活性成分［3］。丹皮酚的药理作用包括抗炎、抗菌、镇痛以及抗凝血等［4］。在临床上，丹皮酚片被用于头痛、类风湿关节炎等疾病的治疗，丹皮酚软膏被用于湿疹、皮炎等皮肤病的治疗。丹皮酚能够在多种癌症（如胃癌［5］、膀胱癌［6］以及食管癌［7］等）中抑制癌细胞增殖，促进癌症细胞凋亡。丹皮酚在CRC中发挥治疗作用。LI等［8］发现，丹皮酚通过抑制PGE2的生成和COX-2蛋白的表达，促进CRC细胞的凋亡。LIU等［9］发现丹皮酚通过抑制Wnt/β-catenin途径来抑制CRC细胞的增殖，并诱导其发生细胞周期阻滞。

本研究基于网络药理学探索了丹皮酚治疗CRC的核心药物靶点与关键信号通路，旨在为丹皮酚在CRC治疗方面的临床转化提供更加充分的证据。

1 材料与方法

1.1 数据库检索及丹皮酚药物靶点的筛选

在PubChem数据库获得丹皮酚的Smiles信号。将Smilesk号输入到SwissTargetPrediction与TargetNet 2个数据库中检索丹皮酚的药物靶点。SwissTargetPrediction数据库中可能性值 （Probability） 排序前15名的基因被认为是丹皮酚的可靠药物靶点［10］；Target-Net数据库中可能性值>0的基因被认为是丹皮酚的可靠药物靶点［11］。将检索2个数据库的靶点合并与去除重复后即为丹皮酚的药物靶点。

1.2 数据库检索及CRC疾病靶点的筛选

从数据库GeneCards、Mendelian Inheritance in Man（OMIM） 与Therapeutic Target Database （TTD） 获取CRC的疾病靶点。Genecards数据库中Score>50的基因被作为疾病靶点保留。OMIM与TTD数据库检索到的基因均被做为疾病靶点保留。将数据汇总并删除重复项后即为检索到的CRC相关靶点。

1.3 丹皮酚治疗CRC药物靶点的收集

利用Venny在线工具 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 对丹皮酚的药物靶点与CRC的药物靶点取交集并作图，获得的共同靶点为丹皮酚治疗CRC的靶点。

1.4 药物靶点的富集分析

通过Metascape平台对丹皮酚治疗CRC的靶点进行基因本体 （gene ontology，GO） 富集分析与京都基因组数据库 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 信号通路富集分析［12］。方法为输入相交靶点蛋白的“Gene name”，物种选择为“H.sapiens”，且选择Custom Analysis的分析方式，在P≤0.01情况下分别进行GO的生物过程分析和KEGG信号通路分析。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络 （protein-protein interaction networks，PPI） 的构建

利用STRING平台 （https：//www.string-db.org/） 与Cytoscape软件 （版本3.6.0） 完成PPI分析［13］。将药物靶点导入STRING平台的检索栏，设置置信度为0.4，获得PPI结果并下载数据。将PPI数据导入Cytoscape软件进行可视化并获得互作节点评分。以连通性（Degree） 为主要指标对节点蛋白排序，连通性大于均值的蛋白为相互作用的枢纽节点。

1.6 对丹皮酚与枢纽节点蛋白进行分子对接

用2款基于不同算法的软件LeDock与CB-Dock2分别对丹皮酚与枢纽节点蛋白进行分子对接［14-15］。通过其LePro模块自动处理受体蛋白并生成对接配置文件。用PyMOL软件 （版本号2.2.0） 获得受体蛋白的对接口袋，并修改LeDock对接配置文件的口袋位置［16］。导入丹皮酚分子结构后，通过其LeDock模块完成受体蛋白与丹皮酚的对接。上传经PyMOL软件删除配体与水分子的受体蛋白结构文件与丹皮酚结构文件，使用其Auto Blind Docking模块自动探测受体口袋与完成对接。

2 结果

2.1 丹皮酚治疗CRC的药物靶点

从SwissTargetPrediction数据库筛选得到15个丹皮酚药物靶点，从TargetNet数据库筛选到了221个药物靶点。药物靶点经汇总与删除重复项后，最终获得了203个药物靶点。从GeneCards等数据库获得的CRC疾病靶点经汇总与删除重复项后共有710个疾病靶点。药物靶点与疾病靶点进行重复交集比对后最终得到21个丹皮酚治疗CRC的药物靶点，见图1。这些药物靶点包括AR、ATP4A、CHEK2、CNR2、ESR1、KDR、MDM2、MET、MMP9、PDGFRA、PLA-2G2A、PPARG、PTPN22、RARA、RET、SIRT1、SRC、TERT、TLR9、VCAM1以及EP300。部分药物靶点的可能性值以及数据来源等信息见表1。

表1 丹皮酚与结直肠癌的交集靶点列表Tab.1 List of intersecting targets between paeonol and colorectal cancer

图1 丹皮酚靶点与结直肠癌靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of paeonol and colorectal cancer targets

2.2 交集靶点的富集分析

GO富集分析结果显示，丹皮酚治疗CRC的药物靶点富集于性腺发育、防御反应的调节、上皮管的形态变化、对缺氧的反应以及激酶活性的调节等生物过程。根据P值进行排序，排名前20的生物过程见图2。在KEGG信号通路分析中，药物靶点被富集于雌激素信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药以及癌症中的中心碳代谢等33条通路。P值排名前20的信号通路绘图见图3。

图2 GO生物过程富集分析结果Fig.2 Bioprocess enrichment analysis results

图3 KEGG信号通路富集分析结果Fig.3 KEGG signaling pathway enrichment analysis results

2.3 PPI网络分析

STRING平台分析结果显示，输入的21个基因共包含有72种相互作用。Cytoscape重新绘图后，去除无效的2个节点后最终得到19个节点，见图4。Cytoscape计算PPI网络发现连通性 （Degree） 的均值为0.758，高于0.758的节点蛋白有9个，包括SRC、MMP9、PPARG、ESR1、TERT、SIRT1、MET、EP300、MDM2，说明以上9种蛋白是PPI网络中的枢纽蛋白，见表2。

表2 丹皮酚靶点蛋白相互作用网络的分析Tab.2 Analysis of the protein interaction network of paeonol targets

图4 丹皮酚靶点蛋白的相互作用网络Fig.4 Interaction network of paeonol target proteins

2.4 丹皮酚与枢纽蛋白的分子对接

分子对接结果显示，丹皮酚与9个枢纽节点均具有结合潜力。在LeDock预测结果中，与丹皮酚亲和力最高的5种蛋白依次为PPARG、ESR1、MMP9、EP300和SRC。CB-Dock2的预测结果中亲和力最高的5种蛋白依次为MMP9、TERT、EP300、SIRT1和SRC，见表3。综合2种软件的预测结果，SRC、EP300和MMP9在2款软件中均表现出了良好的结合能力，可能为丹皮酚的核心药物靶点，见图5A。SRC、EP300和MMP9通过LeDock预测的最高亲和力结合模式，见图5B。SRC、EP300和MMP9通过CB-Dock2预测的最高亲和力结合模式，见图5C。

表3 丹皮酚与9种枢纽蛋白的分子对接预测结果Tab.3 Predicted results of molecular docking of paeonol with nine hub proteins

图5 丹皮酚与重要靶点蛋白SRC、EP300和MMP9的分子对接模式Fig.5 Molecular docking patterns of paeonol with key target proteins SRC，EP300，and MMP9

3 讨论

丹皮酚是中药材牡丹皮的主要活性成分，具有显著的抗氧化和消炎作用，广泛应用于医疗与保健［17］。丹皮酚能够通过多种分子途径抑制细胞增殖、侵袭以及诱导细胞凋亡和周期停滞，表现出广泛的抗癌作用［18］。研究［8-9］证实丹皮酚具有抗CRC的作用。本研究基于网络药理学方法，从整体出发分析丹皮酚抗CRC的具体作用机制。

本研究结果显示，共21个蛋白涉及丹皮酚的抗CRC作用。通过KEGG富集分析发现这21个蛋白富集于Ras、雌激素和Rap1等信号通路。RAS基因（KRAS与NRAS） 的致癌突变在CRC中十分常见，其不仅驱动癌症进展，还影响放疗、化疗与靶向治疗的治疗效果［19］。雌激素在维持结肠上皮的结构和生理完整性中起到重要作用，雌激素及其受体与CRC的患病风险和癌症转移呈负相关［20］。GO富集分析结果显示，丹皮酚对CRC的治疗作用主要涉及激酶活性的调节、MAPK级联的调控、对缺氧的反应等生物过程。缺氧是肿瘤微环境的特征之一，其诱导的HIF信号通路激活与CRC病情进展和预后不良明显相关［21］。由此可见，丹皮酚对CRC相关信号通路与生物过程具有广泛的调控作用。

通过PPI分析和分子对接，从21个靶点中筛选出SRC、EP300以及MMP9作为丹皮酚的核心靶点。SRC为非受体酪氨酸激酶，可以通过不同的激酶途径 （MAPK，PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT3、PEAK1和Rho/ROCK等） 进行胚胎发育和细胞生长调节，并传导下游信号以参与癌细胞的细胞增殖、血管生成、迁移、侵袭和转移［22］。SRC在CRC的患者中呈显著高表达，并且与肿瘤的转移和生存预后密切相关［23］。MMP9是基质金属蛋白酶家族成员，肿瘤细胞中基质金属蛋白酶的早期表达有助于细胞外基质的重塑，并释放膜结合生长因子，为肿瘤发生奠定微环境。MMP9在血管生成、转移和癌症侵袭中的作用已被证实，并且与癌细胞的存活和扩散相关［24］，其在CRC中高表达并且参与癌细胞的转移［25］。EP300是组蛋白乙酰转移酶，其通过影响染色质重塑调控基因表达。EP300在CRC癌组织中表达异常，其可能通过调控BAX的表达影响CRC的疾病进程［26］。SRC、EP300和MMP9广泛参与到显著富集的信号通路与生物过程。例如，在排名前20的KEGG信号通路中，SRC参与其中11条通路，MMP9参与其中10条通路，SRC与MMP9共同参与的信号通路有6条。以上的结果表明SRC、EP300以及MMP9可能通过多种途径调控CRC细胞的发展进程，有望成为新的治疗靶点。

综上所述，丹皮酚能够靶向SRC、EP300与MMP9，通过调控Ras、Rap1等信号通路与激酶活性、对缺氧的反应等生物过程，发挥治疗结直肠癌的作用。本研究的不足之处是没有进行体内与体外的实验验证，应该在未来的研究中继续探索与补充。