miR-133a调控RUNX2/BMP2信号通路参与激素性股骨头坏死的机制

杨森林，张国秋，李超，李克文

（青海大学附属医院骨科，西宁 810000）

激素性股骨头坏死 （steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH） 是破坏退行性疾病，是近年来随着糖皮质激素广泛应用而引发的股骨坏死疾病［1］。皮质类固醇是引起SONFH发生的最常见原因［2］。SONFH病理上表现为股骨头局部血液循环障碍导致股骨头供血减少、骨髓间充质干细胞 （bone manrrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 成骨分化受到抑制、破骨细胞异常活化，导致骨吸收和新骨重建失衡，最终股骨头坏死、塌陷［3］。目前，SONFH发病机制尚不明确，缺乏统一的治疗方法。因此，寻找相关治疗靶点至关重要。微RNA （microRNA，miRNA） 异常表达影响骨骼代谢［4］。其中，miR-133a在骨骼增殖、分化等功能中发挥重要作用［5］，沉默miR-133a表达能够缓解糖皮质激素诱导的骨质疏松，并影响间充质干细胞功能，在骨代谢中发挥重要作用［6］。生长相关转录因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2） 在骨发育及后期均调解骨形成，RUNX2失活抑制间充质干细胞向成骨分化［7］；骨形态蛋白2 （bone morphogenetic protein 2，BMP2） 能够诱导骨和软骨形成，其靶细胞是未分化的间充质干细胞［8］。进一步研究［9］发现miR-133a能够靶向调控RUNX2，抑制miR-133a能够增强RUNX2的活性和增加骨骼修复能力，推测miR-133a在SONFH中可能发挥类似功效影响骨代谢。本研究分析SONFH患者BMSCs中miR-133a的表达情况，探讨miR-133a调控RUNX2/ BMP2信号通路参与SONFH的机制，旨在为SONFH靶向治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源及处理

收集2021年6月至2022年6月青海大学附属医院接受髋关节置换的SONFH患者 （SONFH组） 骨髓（2 mL） 及股骨颈骨折不愈合患者 （对照组） 骨髓 （2 mL）。本研究获得青海大学附属医院伦理委员会批准 （20210403）。将骨髓与含有抗凝剂的10%胎牛血清α-MEM培养液轻轻混合，取BMSCs （1.073 g/mL） 分离液在离心管中放置至室温，转移至15 mL离心管中，液面上缓慢滴加BMSCs分离液，2 000 r/min离心15 min；离心后箭头吸管轻轻吸取云雾状细胞层，经磷酸缓冲液清洗、2 000 r/min离心5 min，弃上清后加10%胎牛血清α-MEM培养液1 000 r/min离心5 min，弃上清后加10%胎牛血清α-MEM培养液，调整细胞浓度为5×105/mL接种至6 cm板中，置于37 ℃、CO2培养箱培养。

1.2 试剂与仪器

引物由上海生工生物工程有限公司合成，RUNX2-3’UTR-WT、RUNX2-3’UTR-MUT、miR-133a模拟物 （miR-133a mimic）、miR-133a模拟物对照 （mimic con）、miR-133a抑制剂 （miR-133a inhibitor）、miR-133a抑制剂对照（inhibitor con）、si-RUNX2均由广州锐博生物科技有限公司提供。一抗RUNX2、BMP2、骨钙素 （osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原蛋白 （collagen Ⅰ，COL-Ⅰ），二抗山羊抗兔，CCK-8试剂盒 （英国Abcam公司，货号分别为ab236639、ab214821、ab108397、ab34710、ab6721、ab228554）；茜素红染色液 （上海爱必信生物科技有限公司，abs42012987）；油红O染色液 （上海经科化学科技有限公司，WB1016）；cDNA第一条链合成试剂盒 （碧云天科技有限公司，D7178S）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒 （上海翌圣生物科技股份有限公司，11401ES）。主要仪器包括流式细胞仪 （美国BD公司，FACSCalibur）、实时定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 仪 （赛默飞世尔公司，7500）、蛋白凝胶成像仪 （美国Bio-Rad公司，BIO-RADXR）、酶标仪 （深圳汇松科技发展有限公司，MB-530）。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs鉴定：

1.3.1.1 细胞表型鉴定 细胞培养至第3代，经胰蛋白酶消化、1 500 r/min离心15 min，收集细胞沉淀，经磷酸缓冲液清洗后制成1×105/mL细胞，取100 μL荧光标记的抗体［CD71、CD44、CD34、人类白细胞抗原DR等位基因 （human leukocyte antigen DR allele，HLA-DR） ］10 μL室温孵育30 min，磷酸缓冲液洗去未标记抗体，上清中添加300 μL磷酸缓冲液，流式细胞术检测细胞表型。

1.3.1.2 定向诱导BMSCs成骨分化 细胞按照1×104/mL接种至细胞爬片上，置于6孔板中，37 ℃、CO2培养箱中培养24 h，吸取原培养液，加入1×10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸、5 μg/L rhTGF-β1、10%胎牛血清α-MEM培养液；空白对照添加10%胎牛血清α-MEM培养液培养，倒置显微镜每天观察细胞生长及增殖情况。第21天取出载玻片，茜素红染色鉴定成骨分化能力。

1.3.1.3 定向诱导BMSCs成脂分化 细胞按照3×103/mL接种至细胞爬片上，置于6孔板中，待细胞80%～90%时，加入1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素、1 mmol/L吲哚美辛、10%胎牛血清α-MEM培养液；空白对照添加10%胎牛血清α-MEM培养液培养，7 d后取出玻片，油红O染色并拍照。

1.3.2 RT-qPCR检测BMSCs中miR-133a、RUNX2mRNA表达：对照组、SONFH组经鉴定的1×105/mL BMSCs，TRIzol法提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA，RT-qPCR仪检测miR-133a、RUNX2mRNA表达。miR-133a，正向 5’-TTTGGTCCCCTTCAAC-3’，反向 5’-TAGCTATCCTTTGCT-3’；U6，正向5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，反向5’-CAGGGGCCA TGCTAATCTT-3’；RUNX2，正向5’-TTGGAATCGAT GGTAATTATCTTTAG-3’，反向5’-AATCCTATTGCG GTAATCTTACCTTAAT-3’；GAPDH，正向5’-ACGG CAAGTTCAACGGCACAG-3’，反向 5’-GAAGACGC CAGTAGACTCCACGAC-3’。20 μL反应体系：400 ng/μL cDNA 1 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL、正向/反向引物 （10 μmol/L） 各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃、30 s；95 ℃、30 s，miR-133a：61 ℃、30 s；RUNX2：60 ℃、30 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算miR-133a、RUNX2mRNA相对表达水平。

1.3.3 Western blotting检测BMSCs中RUNX2蛋白表达：对照组、SONFH组经鉴定的BMSCs细胞添加蛋白裂解酶冰上裂解细胞20 min，12 000 r/min 4 ℃离心20 min，上清即为总蛋白。每个样品 （20 μg） 分离蛋白，PVDF膜280 mA 40 min转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，对应一抗RUNX2、GAPDH，4 ℃孵育过夜；加入对应二抗室温孵育1 h，蛋白显色液显膜，蛋白凝胶成像仪拍照并定量分析。

1.3.4 双荧光素酶验证miR-133a与RUNX2的靶向位点：生物信息学软件ENCORI/starBase （https：//rnasysu.com/encori/） 预测miR-133a与RUNX2存在结合位点。设计合成RUNX2的3’UTR-WT和MUT，分别与miR-133a mimic或mimic con共转染至SONFH患者骨髓提取的BMSCs中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.3.5 实验分组：实验分为对照组、SONFH组、inhibitor con组、miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组。除对照组外，其他各组均用SONFH分离的BMSCs实验，按照Lipofectamine 2000试剂说明书分别转染inhibitor con、miR-133a inhibitor、miR-133a inhibitor+si-RUNX2，转染6 h后更换为10%胎牛血清α-MEM培养液。

1.3.6 RT-qPCR检测各组细胞中miR-133a、RUNX2mRNA：各组细胞继续培养48 h，参照1.3.2方法检测。

1.3.7 Western blotting检测各组BMSCs中RUNX2蛋白：各组细胞继续培养48 h，参照1.3.3方法检测。

1.3.8 CCK-8检测细胞增殖情况：各组细胞按照1×105/mL置于96孔板中，每孔100 μL，10%胎牛血清的α-MEM培养液置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，分别在培养24、48、72 h时各组对应添加CCK-8试剂 （10 μL） 继续培养2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度 （optical density，OD）值。

1.3.9 茜素红染色鉴定细胞矿化能力：各组细胞按照1×105/mL置于6孔板中，继续培养21 d，茜素红染液染色，倒置显微镜下观察矿化结节情况。显微镜视野下每个样品计数5个孔，采用Image-J软件定量分析，每个视野下矿化结节数量为矿化结节相对数量。

1.3.10 Western blotting检测BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白：各组细胞继续培养48 h，参照1.3.3方法检测。

1.4 统计学分析

利用GraphPad Prism7.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，两组比较采用t检验；多组比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs鉴定结果

结果显示，对照组和SONFH组细胞表面CD71、CD44表达，CD34、HLA-DR不表达。见图1。成骨分化21 d茜素红染色对照组、SONFH组均出现矿化结节，结节呈红色散落分布；空白对照细胞为阴性。见图2。成脂分化7 d油红O染色，显微镜下对照组、SONFH组均可见脂滴被染，呈橙红色；细胞内脂滴沉着，且数量较多，部分细胞内脂滴融合变大成泡状，细胞核位于中央或被挤向外周。空白对照显微镜下未见橙红色出现，未形成脂滴。见图3。以上结果提示BMSCs提取成功。

图1 BMSCs鉴定结果Fig.1 BMSCs identification results

图2 茜素红染色结果 ×40Fig.2 Alizarin red staining results ×40

图3 油红O染色结果×100Fig.3 Oil red O staining results×100

2.2 对照组和SONFH组BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA及蛋白表达

结果显示，与对照组比较，SONFH组BMSCs中miR-133a表达升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表达降低 （P< 0.05）。见图4、表1。

表1 对照组和SONFH组BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表达 （n = 6 ）Tab.1 Expression of miR-133a and RUNX2 mRNA and protein in BMSCs in the control group and SONFH group （n = 6 ）

图4 对照组和SONFH组BMSCs中RUNX2蛋白表达Fig.4 Expression of RUNX2 protein in BMSCs in the control group and SONFH group

2.3 miR-133a与RUNX2的靶向关系验证

结果显示，miR-133a与RUNX2存在特异性结合位点，见图5。双荧光素酶验证结果显示，与mimic con+RUNX2 3’UTR-WT组 （1.01±0.08） 相比，miR-133a mimic+RUNX2 3’UTR-WT组 （0.52±0.06） 细胞荧光素酶活性下降 （P< 0.05）。而mimic con+RUNX2 3’UTRMUT组 （0.99±0.07） 与miR-133a mimic+RUNX2 3’UTRMUT组 （1.00±0.11） 细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义 （P> 0.05）。

图5 预测miR-133a与RUNX2的特异性结合位点Fig.5 Predicted specific binding sites of miR-133a and RUNX2

2.4 各组BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表达

结果显示，与对照组相比，SONFH组、inhibitor con组、miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中miR-133a表达升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表达降低 （P< 0.05）。与SONFH组和inhibitor con组比较，miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中miR-133a表达降低 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表达升高 （P< 0.05）。与miR-133a inhibitor组比较，miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中miR-133a表达升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表达降低 （P< 0.05）。见图6、表2。

表2 各组BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表达 （n = 6 ）Tab.2 Expressions of miR-133a，RUNX2 mRNA，and RUNX2 protein in BMSCs among the groups （n = 6 ）

图6 各组BMSCs中RUNX2蛋白表达比较Fig.6 Comparison of RUNX2 protein expression in BMSCs in each group

2.5 miR-133a对各组BMSCs增殖的影响

24、48、72 h检测细胞增殖的结果显示，与对照组相比，SONFH组、inhibitor con组、miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组OD值降低 （P<0.05）。与SONFH组和inhibitor con组相比，miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组OD值升高 （P< 0.05）。与miR-133a inhibitor组相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2组OD值降低 （P< 0.05）。见表3。

表3 各组不同时间OD值比较 （n = 6 ）Tab.3 Comparison of OD values at different times in each group （n = 6 ）

2.6 miR-133a对BMSCs矿化的影响

结果显示，与对照组 （68.48±7.18） 相比，SONFH组 （23.42±3.26）、inhibitor con组 （23.51±3.44）、miR-133a inhibitor组 （53.67±6.26）、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组 （34.85±4.09） BMSCs矿化结节相对数量减少 （P< 0.05）。与SONFH组和inhibitor con组相比，miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs矿化结节相对数量增加 （P< 0.05）。与miR-133a inhibitor组相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs矿化结节相对数量减少 （P< 0.05）。见图7。

2.7 miR-133a对各组BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表达的影响

与对照组相比，SONFH组、inhibitor con组、miR-133a inhibitor组、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表达降低 （P< 0.05）；与SONFH组、inhibitor con组相比，miR-133a inhibitor组BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表达，miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中BMP2、COL-Ⅰ蛋白表达升高 （P< 0.05）；与miR-133a inhibitor组相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表达降低 （P< 0.05）。见图8、表4。

图8 各组BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表达比较Fig.8 Comparison of BMP2，BGP and COL-Ⅰ protein expression in BMSCs among all groups

3 讨论

近年来由于激素的不规范使用，SONFH发生率明显增加；激素已成为股骨头坏死的第一致病因子［10］。研究［11］发现股骨头坏死患者成骨分化能力明显降低、坏死组织中出现大量凋亡细胞，成骨细胞数量减少和功能障碍，导致成骨能力不足，引起骨修复障碍，加重疾病。BMSCs具有多向分化潜能，在特定条件下能够成骨分化，在伤口愈合、股骨头坏死的治疗中具有重要作用［12］。因此，发现与BMSCs定向分化有关的因子，进而寻找SONFH治疗靶点尤为重要。本研究发现SONFH组BMSCs矿化结节相对数量比对照组减少，提示SONFH患者BMSCs中成骨分化能力降低，进而影响成骨细胞数量，导致骨修复障碍。

miR-133a抑制剂增强转化生长因子-β1诱导的肌成纤维细胞分化，产生高水平胶原蛋白的肌成纤维细胞，从而导致肺弹性和功能丧失［13］。miR-133a模拟物可诱导线粒体生成和成肌细胞分化，而miR-133a抑制剂会减弱细胞分化［14］；miR-133a抑制剂可显著促进糖皮质激素 （地塞米松） 处理的间充质干细胞的细胞增殖、活力和成骨细胞分化，并抑制向脂肪细胞分化［6］。本研究结果显示，SONFH患者BMSCs中miR-133a高表达，BMSCs增殖受到抑制、矿化结节数量减少；降低miR-133a水平后促进细胞增殖、矿化结节数量增加，提示miR-133a可能抑制SONFH患者BMSCs的成骨分化能力和增殖能力。

miRNA靶向调控基因表达影响疾病进展。RUNX2是miR-133a靶基因之一，miR-133a能够靶向抑制RUNX2/BMP2信号通路抑制骨形成，从而负向调节骨折愈合［15］。RUNX2作为成熟成骨分化重要指标和促进分子，在成骨细胞和间充质干细胞中高表达，是骨形成必要转录因子。RUNX2能够通过结合RUNX共有序列 （PuACCPuCA） 调控骨谱系细胞［16］，可调控多种因子发挥作用，且这些调控元件在成骨细胞基因启动子中均可找到［17］。BMP2作为RUNX2下游调控因子之一，可作用间充质干细胞，促进间充质干细胞的成骨分化［18］。BGP、COL-Ⅰ作为成骨细胞晚期表型和功能蛋白，在成骨合成、矿化反应、骨形成中发挥作用［19］。本研究发现miR-133a与RUNX2存在靶向结合位点，并经双荧光素酶验证。降低miR-133a表达能够上调RUNX2表达，进而调控下游BMP2水平，升高BGP、COL-Ⅰ表达促进成骨分化。在降低miR-133a基础上干扰RUNX2可逆转上述过程。提示抑制miR-133a的表达能够靶向上调RUNX2的表达，从而促进BMSCs成骨分化和增殖，进而可能缓解疾病进展。

综上所述，SONFH患者BMSCs中miR-133a高表达，抑制miR-133a表达可通过激活RUNX2/BMP2信号通路促进BMSCs成骨分化、增殖。本研究为临床上SOFNH的治疗提供一定理论依据，但RUNX2仅是miR-133a靶基因之一，miR-133a亦可能通过别的靶基因发挥作用，今后需进一步研究论证。