扁蕾颗粒质量标准提升研究*

石春兰，刘学良，俞雅琼，陈 鹏，年永琪，王永晶，韩达斌，刘海青

（青海省药品审评核查中心，青海 西宁 810007）

扁蕾颗粒是由湿生扁蕾药材经提取制成的单方制剂，有清热燥湿、利湿干黄水功效，临床主要用于治疗小儿腹泻、肠胃炎［1-5］。其收载于《卫生部药品标准·蒙药分册》［6］，质量标准中仅有性状及制剂通则项下规定的检查项，不能有效控制药品质量。为了更全面地控制扁蕾颗粒质量，本试验中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱（HPLC）法测定组方药材有效成分当药苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪，包括Waters 2998 PDA detector 型二极管阵列检测器（美国Waters 公司）；ME204 型电子天平（梅特勒- 托利多仪器＜上海＞有限公司，精度为0.1 mg）；XS105DU 型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；SB25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q2355型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

扁蕾颗粒（三普药业有限公司，批号分别为190702，190703，190704，191002，191003）；木犀草素对照品（批号为111720-202111，含量99.1%），当药苷对照品（批号为111742 - 200501，含量99.27%），均购自中国食品药品检定研究院；1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮对照品（含量＞96%），由中国科学院西北高原生物研究所孙洪发研究员提供；硅胶G 预制薄层板，硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水；湿生扁蕾对照药材，采集于青海省海东市互助县，由青海省药品审评核查中心刘海青主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别［7-9］

分别取5 批次扁蕾颗粒样品各适量，置研钵研细，各取约4 g，转移至具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声（功率350 W，频率35 kHz）处理30 min，滤过，水浴蒸干，残渣加2 mL 甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮适量，分别加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的对照品溶液。按扁蕾颗粒处方及工艺制备缺扁蕾的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。取湿生扁蕾对照药材4 g，加甲醇25 mL，超声（功率350 W，频率35 kHz）处理30 min，滤过，水浴蒸干，残渣加2 mL 甲醇使溶解，作为对照药材溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 薄层色谱法，吸取上述溶液各5µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷- 乙酸乙酯- 冰醋酸（8∶1.5∶0.25，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃下加热数分钟，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果对照品溶液色谱中，在与供试品溶液色谱相应位置显相同斑点，且阴性对照无干扰。详见图1。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇（A）- 0.05 %磷酸水溶液（B），梯度 洗 脱（0～5 min 时20%A →25%A，5～7 min 时25%A，7～30 min 时25%A →55%A，30～35 min 时55%A →90%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL［10-15］。

2.2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取当药苷对照品8.10 mg，木犀草素对照品5.71 mg，1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品7.81 mg，精密称定，分别置10，10，50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备液；分别取5，2，2 mL，置同一20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得当药苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮质量浓度分别为0.201 0，0.056 6，0.015 0 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率50 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按扁蕾颗粒工艺和处方制备不含湿生扁蕾药材的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.3 方法学考察［16-19］

系统适用性试验及专属性试验：精密吸取2.2.2项下3种溶液各10µL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并采用外标法计算进样量和峰面积。结果各待测成分分离良好，阴性对照无干扰，理论板数以待测成分峰计均不低于3 000，分离度均大于1.5。详见图2。

1.当药苷 2.木犀草素 3.1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液图2 高效液相色谱图1.Sweroside 2.Luteolin 3.1，7 - Dihydroxy - 3，8 -dimethoxyxanthoneA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别取当药苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品41.26，14.08，7.81 mg，精密称定，分别加甲醇溶解，制成当药苷质量浓度分别 为0.020 5，0.041 0，0.102 4，0.204 8，0.307 2，0.409 6 mg/mL，木犀草素分别为0.005 6，0.011 2，0.027 9，0.055 8，0.083 7，0.111 6 mg / mL，1，7 - 二羟基-3，8 - 二甲氧基酮分别为0.001 5，0.003 0，0.007 5，0.015 0，0.022 5，0.030 0 mg/mL的系列混合对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，以待测成分质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，当药苷Y1= 13 095 403.87X1+54 113.68（r=0.999 6），木犀草素Y2=25 617 524.61X2+2 368.70（r= 0.999 8），1，7 - 二 羟 基 - 3，8 -二甲氧基酮为Y3= 67 491 848.93X3- 2 666.99（r=0.999 7）。结果表明，当药苷、木犀草素、1，7-二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮质量浓度分别在0.020 5～0.409 6 mg/ mL、0.005 6～0.111 6 mg/ mL、0.001 5～0.030 0 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液（木犀草素、当药苷、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮质量浓度分别为0.056 6，0.201 0，0.015 0 mg/ mL）10 µL，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果当药苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮峰平均峰面积的RSD分别为0.26%，0.16%，0.27%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，8，16，24 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果当药苷、木犀草素、1，7-二羟基- 3，8 - 二 甲 氧基酮峰峰面积的RSD分别为0.22%，0.04%，0.79%（n=5），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为190702）6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果当药苷、木犀草素、1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮平均含量分别为8.30，1.06，0.74 mg/ g，RSD分别为1.06%，0.42%，0.92%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为190702）0.5 g，研细，精密称定，取6 份，置锥形瓶中，均分别精密加入2.2.2 项下当药苷对照品溶液（0.819 2 mg/ mL）5.0 mL，木犀草素对照品溶液（0.558 1 mg / mL）1.0 mL，1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮对照品溶液（0.150 0 mg/mL）2.5 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取5 批样品各约0.5 g，精密称定，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of three components in samples（n=3）

3 讨论

3.1 指标成分选择

3.2 TLC 鉴别试验条件

TLC鉴别研究过程中，针对不同的（极性）提取溶剂（甲醇、乙醇、水），提取方法（超声、回流、冷浸），提取时间（20，30，40 min），展开剂［环己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶9∶0.5）、正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶9∶0.2）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶13.5∶1.5）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶6∶1∶0.7）、三氯甲烷- 甲醇- 甲酸（7∶2∶0.5）、三氯甲烷- 甲醇- 水（15∶5∶1.5），比例均为体积比］，不同薄层板（硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板）进行了考察。根据色谱分离效果、斑点显色结果，最终确定了本试验中的样品制备方法和薄层色谱展开条件，该条件下样品分离良好，斑点清晰，重复性较好。

3.3 样品含量测定提取方法

预试验中比较了超声和回流提取法对3 种待测成分提取率的影响，结果无显著差异，且前者更简便，故选择超声提取。比较了不同提取溶剂（水、甲醇、70%乙醇、95%乙醇、三氯甲烷），提取时间（20，30，40 min）和提取量（25，50 mL）对3种待测成分提取率的影响，最终确定了本试验中的供试品溶液制备方法。国家药品监督管理局官网检索结果显示，扁蕾颗粒仅1 家企业生产，收集到的5 批样品含量测定结果基本接近，说明生产企业在原材料、生产工艺等方面控制较好。

3.4 方法评价

本研究中建立的有效成分的TLC 定性鉴别方法及测定3 种主要有效成分含量的HPLC 法，方法简便、高效，结果准确，能为扁蕾颗粒的质量控制提供参考。