复方甲硝唑阴道栓检验方法探索性研究*

牛龙青，张秉华，衷红梅，杜亚俊，周志云

（陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065）

复方甲硝唑阴道栓适用于治疗滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎、细菌性阴道炎和老年性阴道炎、非特异性阴道炎及支原体感染、淋病双球菌感染等疾病。不良反应主要表现为胃肠道不适、中枢神经系统异常、过敏反应等。当前该药有国内批准文号3 个，生产厂家2 家，规格为0.45 g 或3 g。现行的《美国药典》《日本药局方》及《中国药典》均收载甲硝唑原料，但均未收载复方甲硝唑阴道栓，各企业均执行原国家食品药品监督管理局国家药品标准［WS - 1001 -（HD - 1483）- 2003］（下文简称《标准》），但其自2003 年批准后至今（截至发稿时）无任何增、修订，已不能满足严格控制药品质量的要求。本研究中按此标准对复方甲硝唑阴道栓样品进行检验，评价该产品的质量现状，并针对发现的问题开展探索性研究，从有效性、安全性角度提出完善制剂质量控制标准的建议。现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

1.1 仪器

LC-2030 3D型高效液相色谱（HPLC）仪、UV2600型紫外- 可见分光光度（UV）计（日本Shimadzu 公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；XPE205 型及ME204 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg 或0.1 mg）；RC1208D 型溶出度仪（天津市天大天发科技有限公司）；MINI-Q IQ 7000 型高纯水机（美国Millipore 公司）；TOMY SX-500 型卧式矩形压力蒸汽灭菌器（上海华成医用核子仪器公司）；MJ-250-11型霉菌培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；BX53 型电子显微镜（日本Olympus 公司）；pH 酸度计（赛多利斯科技＜北京＞有限公司）。

1.2 试药

7批复方甲硝唑阴道栓样品，均为2022年国家抽验样品，涉及2家生产企业（企业1有3批，企业2有4批），均未提供原辅料；甲硝唑原料药共5 批，分别来自5 家企业；2-甲基-5-硝基咪唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100191-20180，含量100.0%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］，白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］，黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均来自中国医学细菌菌种保藏管理中心。

2 方法与结果

2.1 法定检验

依据前述《标准》，主要检验项目包括性状、鉴别、质（重）量差异、融变时限、微生物限度和含量测定。结果7批样品各项目检测结果均合格。

2.2 探索性研究

2.2.1 有关物质检测方法建立

参考文献［1-3］，经预试验考察优化，确定样品有关物质测定条件为，色谱柱为Welch Ultimate XB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为甲醇- 水（20∶80，V/V）；流速为1.0 mL/ min；检测波长为315 nm；柱温为30 ℃；进样量为20µL。测定样品含量时［4-5］，将上述条件中检测波长改为320 nm，进样量改为10 µL，其余色谱条件不变。依法制备待测溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录典型色谱图，详见图1和图2。

A.样品 B.原料药图1 甲硝唑有关物质典型色谱图A.Samples B.APIsFig.1 Typical chromatograms of metronidazole - related substances

1.2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑图2 对照品溶液高效液相色谱图1.2 - Methyl - 5 - nitroimidazoleFig.2 HPLC chromatograms of reference solution

按2020 年版《中国药典（二部）》甲硝唑限度要求，对样品进行有关物质杂质分析，发现7批样品均检出甲硝唑已知杂质（2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑），同时检出个别其他单个杂质。2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑按外标法计算，检出范围为0.002%～0.007%；其他单个最大杂质检出范围为0.002 6%～0.039%，杂质总量检出范围为0.004%～0.05%。各企业样品已知杂质、其他单个最大杂质和杂质总量分布较均匀，杂质水平无明显差异。企业1的3批样品有关物质考察结果显示，总杂质含量稍偏大，其中1批样品有关物质杂质考察结果出现离散现象，提示该生产企业的生产工艺可能存在潜在风险。

2.2.2 体外释放试验

根据原国家食品药品监督管理总局药品审评中心（CDE）《局部作用常见阴道制剂（阴道片、阴道栓）仿制药的评价技术要求（意见通知稿）》（简称《技术要求》），参考文献［6-9］，建立样品释放度考察方法，选择2 种方法对样品开展体外释放试验研究。2 种介质的制备均采用篮法（栓剂专用溶出篮），取乙酸钠1.22 g，加水溶解，然后加入2 mol/L冰醋酸溶液20.5 mL，用水稀释至1 000 mL，摇匀，即得pH 4.0醋酸盐缓冲溶液（介质1）；称取磷酸二氢钾0.68 g，加0.1 mol/ L 氢氧化钠溶液15.2 mL，用水稀释至100 mL，摇匀，即得pH 6.5 磷酸盐缓冲溶液（介质2）。取介质1，2 各900 mL，转速均为100 r/min，分别模拟正常阴道pH 及疾病状态pH。不同介质下样品的释放曲线见图3。

A.介质1 B.介质2图3 不同介质下样品的释放曲线A.Medium 1 B.Medium 2Fig.3 Release profiles of samples under different media

可知，企业1 在2 种介质中的释放度均优于企业2样品。其中，企业1样品在介质1环境下，8 h及24 h平均释放度分别为27%，52%，在介质2 环境下分别为35%和65%；企业2的4批样品在介质1环境下分别为7%和15%，介质2 环境下分别为6%和12%（按药典要求保留有效值，下同）。考虑到人体胃部和阴道环境差异较大，阴道体液量较少且蠕动幅度和频率也远不如胃部，在转速100 r/ min 条件下，2 家企业样品释放度仍明显过低。

此外，还用3 种固体制剂体外释放模型［10-11］对样品释放度的考察结果进行了数学模型拟合［12-13］，拟合结果见表1。可见，不同批次样品用不同释放模型拟合的结果基本一致，Weibull 分布和Riger-Peppas 方程拟合结果较好，R2多在0.99左右。

表1 样品释放度拟合结果Tab.1 Results of release rate fitting of samples

2.3 微生物限度检查方法适用性试验

依据2020 年版《中国药典（四部）》附录“微生物限度检查标准”要求，样品的微生物检验指标为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，采用中和- 薄膜过滤- 分膜法，检验不同厂家样品两指标的回收比，公式为，回收比=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数，比值在0.5～2.0范围内即为方法有效。控制菌栓剂为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌［14-16］。采用中和培养基稀释法进行了控制菌检查方法适用性试验，分别设立试验组、阳性组和阴性组，革兰染色镜检，前两组均应检出3 种控制菌，阴性组应无任何菌落生长。

结果所有供试品中，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均符合规定，均未检出大肠埃希菌。

2.4 含量测定

采用建立的HPLC 法和《标准》中的UV 法分别测定各批样品含量，结果含量均值分别为99.8%和99.5%，基本一致。

3 讨论

3.1 杂质来源

将样品的检出杂质与5 家甲硝唑原料生产企业的原料有关物质考察结果进行比较，发现杂质种类、个数基本一致，说明样品生产过程中基本不会引入其他工艺杂质。根据《技术要求》，应重点研究制剂的降解产物，包括原料药的降解产物或原料药与辅料和/或内包材的反应产物，分析原料药降解途径，结合样品有关物质的考察结果，2家生产企业均检出已知杂质2-甲基-5-硝基咪唑和其他单个杂质，建议2 家生产企业对样品的有关物质进行控制，以更好地控制制剂质量。

3.2 释放度考察

试验中发现，2 家生产企业样品的释放度均过低。Riger-Peppas 方程可用来描述固体制剂药物的释放机制，公式中释放指数（n）是表征释放机制的特征参数，当n≤0.45 时，为Fick 扩散；当0.45 ＜n＜0.89 时，药物释放机制为non-Fick扩散（Anomalous Transport），即为骨架溶蚀与药物扩散共同控制的释药机制；当n≥0.89时，为骨架溶蚀机制。样品用Riger-Peppas 方程拟合，各批次样品释放指数均在≥0.45～＜0.89 范围内，拟合结果表明，样品属骨架溶蚀与药物扩散共同控制的释药机制。

3.3 含量测定方法考察

本研究中测定样品含量时发现，采用HPLC 法测定的同一生产企业样品含量结果误差范围较大，分析原因可能是该法既是物质的分离方式，也是物质的检测方式，其实际上是先将不同物质分离，然后将分离的单一物质进行紫外光谱检测分析，因此其灵敏度更高，试验结果干扰更小。此外，本研究中发现2 种方法测得的生产企业1 的样品含量结果均高于生产企业2，且前者2 种方法测定结果的误差范围均小于后者，这与前者释放度均优于后者的考察结果一致，均提示生产企业2工艺生产可能存在一定问题。

3.4 小结

阴道炎是妇科常见的炎性反应疾病，其临床表现为阴道瘙痒、白带异常、泌尿系统刺激征。患者如不能得到及时有效的治疗，可加重病情，影响生殖功能。年轻和更年期妇女阴道上皮薄，细胞内糖原减少和雌激素缺乏，阴道pH 约为7，抵抗力较弱，易造成感染。复方甲硝唑阴道栓可提高患者阴道壁的弹性，对阴道细胞有良好的保护作用，其主要成分甲硝唑能有效抑制细菌，杀死滴虫。老年阴道炎患者雌激素水平及阴道黏膜弹性下降，使用复方甲硝唑阴道栓治疗，既能治疗阴道炎，又能降低不良反应发生率，具有较高的应用价值。

复方甲硝唑阴道栓是我国治疗阴道炎特有的复方制剂，研究发现，影响制剂质量的因素主要有以下几方面：一是原料药质量（有关物质），原料药中杂质的量直接决定制剂中杂质的量；二是处方与生产工艺关系到制剂的释放（溶出）情况。药物的吸收取决于药物从制剂中的溶出或释放、在生理条件下的溶解及在作用部位的渗透，而药物的溶出和溶解对吸收具有重要影响。释放度是活性药物成分在规定条件下从制剂中溶出的速率和程度，其可考察药品批间质量的一致性，并提示可能的体内生物利用度问题，考察结果显示，2家生产企业样品的释放度均严重过低，且存在较大的批间差异和批内差异，反映出2家生产企业生产工艺均存在不同程度的问题。

综上所述，目前复方甲硝唑阴道栓总体质量较好，但国内2 家生产企业样品均存在不同程度的生产工艺问题，建议生产企业对复方甲硝唑阴道栓的处方进行更深入的研究，确定更合理的处方工艺，特别是对样品体内生物利用度进行进一步考察。此外，该制剂为复方制剂，但现行标准仅对甲硝唑含量等进行了相关控制，建议提高质量标准，进一步提高药品质量。