五匹风高效液相色谱指纹图谱及多指标成分定量分析*

陈 冰，孙 绪，金倩倩，张 宝，李勇军，李 悦△

（1.贵州省贵阳市妇幼保健院·贵州省贵阳市儿童医院，贵州 贵阳 550003； 2.贵州省食品药品检验所，贵州贵阳 550004； 3.贵州医科大学药学院·贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）

五匹风为蔷薇科委陵菜属植物蛇含委陵菜Potentilla kleinianaWight.et Arn 的新鲜或干燥全草，别名蛇含、五爪龙、五匹风、五皮草，主要分布于我国贵州、湖南、江西、辽宁、黑龙江等地［1-2］。五匹风在贵州蕴藏丰富，因其具有良好的清热解毒、祛风止咳等功效，贵州少数民族地区常用其治疗咳嗽、乳腺炎、风湿关节炎等疾病［3-5］，现收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003版）［1］。五匹风具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血糖功效，其药理作用与其含有的大量鞣质、黄酮、萜类成分有关［6-11］。目前，关于五匹风药材分离鉴定化合物的研究报道较少，其成分主要包括黄酮类、鞣质类、酚类、萜类等［12-16］。国内外对其质量控制的研究报道亦较少，现行质量标准仅以五匹风药材的性状及显微鉴别作为质量控制指标，质量控制项目单一，不能有效、全面地控制药材的质量。因此，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法建立贵州不同产地和批次五匹风药材的指纹图谱，并对5种指标成分进行含量测定，以期为提升五匹风药材的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AE240 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O- β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L -吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸对照品（贵阳市儿童医院药学部实验室自制，含量分别为98.82%，99.42%，97.66%，98.40%，99.42%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。五匹风药材（样品信息见表1），经贵州医科大学刘春花副教授鉴定为正品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱建立及分析

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）- 0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～12 min 时10%A →18%A，12～30 min 时18%A →40%A，30～35 min 时40%A →30%A，35～50 min 时30%A →90%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；进样量：20µL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别称取3，3'- 二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解制成质量浓度分别为1 118.605，851.035，654.300，505.759，1 073.380µg/mL 的单一对照品贮备液；分别精密量取2.0，0.8，0.8，0.8，1.6 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得质量浓度分别为223.72，68.08，52.34，40.46，171.74µg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取药材样品粉末（过3 号筛）1.0 g，精密称定，置50 mL 具塞三角瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，称定质量，超声（功率400 W，频率40 kHz）处理60 min，放冷至室温，再次称定质量，用60%乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上层液置离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.1.3 方法学考察

精密度试验：取供试品溶液（编号S3）适量，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。以3号峰（山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷）为参照峰（下同）计算，结果6个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（编号S3）适量，在室温下分别于0，2，4，8，24，48 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果6 个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置48 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号S3）适量，按2.1.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果6 个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.4 HPLC 指纹图谱的建立及相似度评价

取15 批药材样品适量，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，得15 批药材样品的HPLC 叠加指纹图谱（见图1），将图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 年A 版）进行分析，利用中位数法进行多点校正后自动匹配生成对照指纹图谱（见图2）。将15批药材样品色谱图与对照指纹图谱匹配，并进行相似度评价，结果见表2。

图1 15批五匹风药材样品高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 Superimposed HPLC fingerprints of 15 batches of Potentilla kleiniana

2.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃葡萄糖苷 3.山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L - 吡喃鼠李糖苷4.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃木糖苷5.3，3' - 二甲氧基鞣花酸 6.3，3'，4' - 三甲氧基鞣花酸图2 五匹风药材样品高效液相色谱对照指纹图谱2.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - glucopyranoside 3.Kaempferol - 3，7 - di - O - α - L - rhamnopyranoside 4.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - xylopyranoside 5.3，3' - di - O - methylellagic acid 6.3，3'，4 '- tri -O - methylellagic acidFig.2 Reference HPLC fingerprints of Potentilla kleiniana

表2 15批五匹风药材样品相似度评价结果Tab.2 Results of similarity evaluation of 15 batches of Potentilla kleiniana

2.2 含量测定

2.2.1 方法学考察

系统适用性试验：取2.1.2项下混合对照品溶液和供试品溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处有相应色谱峰，分离度均大于1.5，理论板数以待测成分峰计均高于27 000，表明方法适用性良好。详见图3。

1.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃葡萄糖苷 2.山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L - 吡喃鼠李糖苷3.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃木糖苷4.3，3' - 二甲氧基鞣花酸 5.3，3'，4' - 三甲氧基鞣花酸A.混合对照品溶液 B.供试品溶液图3 高效液相色谱图1.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - glucopyranoside 2.Kaempferol - 3，7 - di - O - α - L - rhamnopyranoside 3.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - xylopyranoside 4.3，3' - di - O - methylellagic acid 5.3，3'，4 '- tri -O - methylellagic acidA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，逐级稀释，制备成系列混合对照品溶液，分别按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果表明，5 种待测成分在各自的线性范围内与峰面积线性关系良好。结果见表3。

表3 线性关系及定量限、检测限考察结果（n=6）Tab.3 Results of the linear relation test，limit of quantification and limit of detection（n=6）

检测限与定量限：精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以信噪比（S/N）为10 和3 时对应待测成分的质量浓度分别为定量限和检测限。结果见表3。

精密度试验：取供试品溶液（编号S3）适量，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果5 种成分的RSD均小于3.0%（n= 6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（编号S3）适量，分别于室温下在0，2，4，8，24，48 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果5 种成分峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置48 h 内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号S3）适量，按2.1.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果5 种成分峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批样品（编号S3）粉末约0.5 g，共6 份，精密称定，按要求分别加入已知含量的3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚- 3，7 - 二-O-α-L- 吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸的对照品111.860，34.041，26.041，26.172，20.230，85.870µg，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表4。

2.2.2 样品含量测定

取15 批药材样品粉末各适量，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品中5 种待测成分的含量。结果见表5。可见，15 批样品中，3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸的含量范围分别为0.162%～0.879%、0.011%～0.253%、0.019%～0.047%、0.019%～0.209%、0.037%～0.107%，平均含量分别为0.366%，0.100%，0.032%，0.049%，0.065%。

3 讨论

3.1 提取方法选择

预试验中分别考察了不同提取溶剂（30%甲醇、60%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、乙醇、水），提取时间（15，30，60 min），提取方式（超声法、回流法）对样品中有效成分的提取效果，在考虑供试品制备方法的高效、简单、方便操作等因素前提下，在选择提取溶剂为60%乙醇，超声60 min 时，供试品溶液色谱图中色谱峰数量较多，且分离效果较好，共有峰面积较大，故选择此条件制备供试品溶液。

3.2 色谱条件优化

预试验中对不同检测波长进行考察，发现15 批药材样品在327 nm 波长处出峰较多，共有峰较多，基线分离效果好，比较后最终选择327 nm 作为检测波长；比较了不同色谱柱的分离效果，发现Eclipse XDB - C18柱（150 mm×4.6 mm，5µm）具有较高柱效，能较好地分离待测成分与杂质峰；比较了不同流动相（乙腈-0.5%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水）的试验效果，发现当流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液时，各色谱峰的峰形及分离度均较好；还考察了不同柱温（20，30，35 ℃）及流速（0.8，1.0，1.2 mL/ min），发现30 ℃为分析的最佳柱温，流速采用1.0 mL/min时色谱峰分离效果优于0.8，1.2 mL/min，故确定本试验中的试验条件为最佳色谱条件。

3.3 方法评价

本研究中指纹图谱结果表明，15 批五匹风药材样品共有峰有6 个，相似度均大于0.885，说明贵州省内各产地的药材质量具有较高的均一性。含量测定结果显示，五匹风药材中平均含量由高到低分别为3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷，3，3'-二甲氧基鞣花酸- 4'-O-β- D - 吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7 - 二-O-α-L- 吡喃鼠李糖苷及3，3'- 二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷在各批次间的含量差异较小；山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸各批次间的含量差异较大，含量差异可能由产地、采收期等多种原因导致，具体原因还需进一步深入研究。

本研究中所建立的指纹图谱及含量测定方法简便、稳定、准确，结果可靠，可为五匹风药材的全面质量控制提供参考。