林下铁皮石斛不同发育时期的成分变化研究进展

黄佑国施蕊李彪何舒严星茹张澳何霞红

(1.西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室/昆明生态林业产业国际科技研发中心/西南林业大学园林与园艺学院，云南 昆明 650224；2.玉溪三农高原特色现代农业有限责任公司，云南 澄江 652599)

前言

铁皮石斛为兰科石斛属植物，是一类药用范围较广的中药，也是一类观赏植物，被称为“救命仙草”，今人称之为“药中黄金”，国际上有“药界大熊猫”的美称。据《神农本草经》记载，石斛有2300多年的药用历史。铁皮石斛为多年生草本，茎直立、圆柱形，长而细；生长在海拔100～3000m的地区，花期通常在4—6月。这类植物一般附生于半阴湿的岩石上，不耐寒，特别是其幼苗，对生长条件要求非常苛刻。

自然界中的野生铁皮石斛生长缓慢且繁殖能力差，以及长期以来过度采摘、生态破坏等因素，野生资源面临着严重威胁。因此，现阶段国内禁止采摘野生品种。市场上流通的铁皮石斛主要由人工培育而来，我国很多地区均有种植。然而这种植物生长期间所采用的大肥大水种植模式、农药滥用导致农残重金属超标导致铁皮石斛的品质下降。因此，实现铁皮石斛药材的零化学农药、零化学肥料施用，保障中药材的安全性和优质性极为重要。陈宝玲等的报道中指出立体复合栽培模式能够显著提高该药物的经济效益，且生态环保，这种栽培模式值得在各大种植区进行推广。

根据《中华人民共和国国家药典委员会》(2020年)，进入中国药典的品种有铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、金钗石斛(D.nobile Lindl.)、霍山石斛(D.huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum Lindl.)和流苏石斛(D.fimbriatum Hook)等。但铁皮石斛因其较高的药理价值而备受关注并且被单独列出。铁皮石斛(D.officinale Kimura et Migo)含有多种重要活性成分，包括多糖、生物碱、氨基酸与微量元素、联苄类和菲类以及黄酮类等。铁皮石斛在治疗萎缩性胃炎、糖尿病、癌症、心血管疾病和白内障以及延缓衰老等方面起着重要作用，铁皮石斛多糖(DOPs)和生物碱，以及少量黄酮类化合物能治疗低血糖，并具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤作用。铁皮石斛的生物碱具有抗氧化和神经保护活性作用，铁皮石斛具有良好的抗细胞毒性和抗氧化功能。

目前有关铁皮石斛有效成分可参考的文献研究也比较多，主要是对铁皮石斛的茎展开研究，对其花、叶的研究并不多见。近年来，人们发现这种植物的花含有大量的资源成分，如有机酸类和萜类等，这些成分具有较强的生物活性，可以起到增强机体体质、治疗炎症、抗氧化、抗衰老、镇痛等作用。李芳等探讨了铁皮石斛茎、叶、花不同部位黄酮含量，发现这种物质在花中的含量最高。之后探讨了黄酮的药用价值，指出该物质具有很高的抗氧化活性，可以有效清除体内自由基、延缓人体细胞的氧化和衰老，是极具开发潜力的天然抗氧化剂。铁皮石斛作为热门中药材之一，除了其药用部位茎以外，石斛花、石斛叶药理作用的研究也具有重要意义。

铁皮石斛林下原生境种植也取得了初步成功。杨洪斌通过在瑞丽中缅边境干邦亚山区种植铁皮石斛10年来的实践，逐步摸索出仿野生林下种植的实用技术；之后对石斛药用价值进行研究，结果显示，其药用品质可以与野生铁皮石斛媲美。陈向东配制出林下种植营养土并进行植物栽培，之后展开一系列节约、环保的实验，最终确定出营养土的最佳配比，这为石斛的栽培提供了新思路，该项研究在当时受到学术界的广泛关注。

迄今，对林下铁皮石斛的研究和报道虽已较多，但林下铁皮石斛成分代谢变化和分子机制尚不清楚。随着高通量组学在中药研究的应用，代谢组是基因组与表型组的媒介，代谢组的研究对理解植物代谢机理，提升植物的抗逆性具有积极意义，为增加作物产量与品质提供了理论上的指导。转录组可以检测到所有正在表达的基因的变化动态，结合基因表达和代谢物积累的数据基于“代谢物+基因”共表达分析，解析生物分子功能和调控机制，能有效筛选出铁皮石斛次生代谢产物的代谢通路和有效成分累积的关键调控基因，进而开展后续的数据挖掘。本研究利用代谢组学以及转录组学等分析林下铁皮石斛特定条件下特定时间的生物代谢积累规律以及构建相关时间内代谢网络。

1 不同种植模式的铁皮石斛研究进展

由于铁皮石斛长期大水大肥的人工种植，导致其产量高、品质低，吴纪贤研究了活树捆绑和横杆捆绑种植方式的可行性，并与温室大棚种植进行对比，前者能够节约土地资源，尤其是在土地资源紧张的地区，捆绑种植技术可在有限的空间内实现植物多样化，且易于管理和维护，在种植业提质增效、成本管理方面是温室大棚无法企及的。近年来，有学者探讨了铁皮石斛仿野生林下种植新模式的推广价值。李帆等基于UPLC-MS/MS代谢组学技术分析不同栽培模式下铁皮石斛类黄酮化合物的差异性发现，林下活树附生和岩壁附生栽培明显提升黄酮、类黄酮化合物的生物合成水平，保障了药材质量。王金旺等以铁皮石斛为研究对象，经过长期的摸索后，提出3种人工培育策略，即活树附生栽培、新伐毛竹附生栽培、岩壁附生栽培，之后对不同栽培模式下的石斛展开生长性状以及检测分析，进而确定出其折干率、水分、灰分等的含量，经过对比得出最佳栽培方式。研究发现，该植物采用新伐毛竹附生栽培，其长势较活树附生栽培差，但比岩壁附生种植好。其品质也是活树附生栽培略好。

Wang等采用不同的分离方法和技术，从不同附生立木和种质的石斛中分离到内生真菌，包括曲霉、镰刀菌等，并对这些真菌进行形态学和分子生物学研究，以确定其特征。这为石斛与内生真菌的相互关系研究提供了新思路，为该植物的生物防治和生态保护提供了参考。

2 铁皮石斛关键部位间差异研究进展

铁皮石斛是珍贵的中药材，属于兰科植物，具有多种功效。在中国和其他亚洲国家[1]，由于其高药用价值，过度开发和栖息地破坏而濒临灭绝，目前我国已出台相关法规禁止采摘野生石斛。

Wang等测定了铁皮石斛全植株、根、茎、叶和PLB等各器官中多糖、黄酮类和生物碱的含量，通过方差分析和多重比较检测样本间3个成分含量存在显著差异，DOPs在植物器官中的分布位茎>全植物>叶>根。铁皮石斛茎中多糖含量最高，为402.93mg·g-1DW(干重)。而PLBs的多糖含量低于植物器官，平均含量为75.30mg·g-1DW，PLB和叶片可以分析这些代谢物特定生物合成途径的候选酶编码基因的表达水平。基于转录组测序中基因差异表达(DEGs)的结果，鉴定验证了参与主要代谢物生物合成途径的酶的编码基因。首次报道了铁皮石斛生物碱生物合成中SG、GS和VS等酶的编码基因。此外，一些参与调控生物碱生物合成的转录因子在铁皮石斛的叶片和PLB中存在差异表达。

Yang Qian-yu等基于以往发表的拟南芥CaM和CML基因家族蛋白序列，对小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的全基因组进行搜索，结果显示，这2种植物的全基因组中均预测到4个CaM蛋白和54个CML蛋白；之后对二者作进一步的系统进化分析，将CaM和CML蛋白家族各分为10个亚家族；对小兰屿蝴蝶兰进行检测时，结果显示，该植物中9个基因在叶中的数量比在花、茎、根中的数量更多，2个基因在叶中的数量相对更多，3个基因在花中的数量相较于其他部分的含量更多；对铁皮石斛进行检测时，结果显示该植物中4个基因在与美胞胶膜菌共生萌发文库中的数量比在非共生文库中的数量更多。由此得出以上2种蛋白家族基因在兰科植物不同组织中的含量各异，且二者均影响着石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发的生物学调控。这为后续人类深入研究CaM和CML基因家族的生物学特性做了铺垫。

Lin J B等借助Illumina HiSeq 4000高通量测序方法检测并探讨铁皮石斛植物甾醇的生物合成机制，在此基础上，进一步对比分析植物甾醇生物合成关键酶基因的表达情况。发现铁皮石斛植物甾醇生物合成分为3个阶段，共有50个Unigenes(30种酶)参与。经过长期的实验研究后，发现DXR和HMED的数量较MK和MVD更多；在植物成熟阶段，其茎、叶SMT1的数量相较于生长期更多，SMT2则为相反的情况。以上研究结论为后续石斛的开发利用提供了参考。

Han Rong-Chun等以霍山石斛为研究对象，克隆出GMPP基因并借助qPCR技术检测霍山种植区3种不同石斛(霍山石斛、铁皮石斛、铜皮石斛)中GMPP基因的数量，发现霍山石斛GMPP基因cDNA序列长1867bp，进一步的研究结果显示，基因共编码415个氨基酸；之后对石斛进行序列分析，由此得出其所含GMPP与铁皮石斛、黄花石斛相似性高达99%，此外还展开了一系列进化树分析，发现这3种石斛的GMPP亲缘关系较近；qPCR检测结果表明，GMPP基因在霍山石斛茎中数量最多，在叶组织也分布较为集中，然后是花，根中表达量最低。另外，霍山种植的3种石斛中霍山石斛的基因数量最多，这是由于这些组织中多糖含量各异，两者之间存在密切相关性。这对阐明霍山石斛多糖生物合成机制具有积极意义。

3 铁皮石斛不同发育时期关键物质研究进展

铁皮石斛(Dendrobium offcinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生铁野生繁殖及市场供应。当前铁皮石斛已在生物学、化学、药理学等方面取得一定的研究进展。然而从总体来看，人类对于基因功能的研究较薄弱，不利于植物的进一步开发利用。

从现有的情况看，铁皮石斛基因组草图序列已公布，这对于后续学术界揭示该植物及其近似种的系统繁育机制具有重要意义。在铁皮石斛基因组中，人类发现了数十个CIPK编码基因，对这些基因之间的分子功能、信号网络的相互作用机制，以及基因调控植物生长的机制相关研究较少。而这方面的研究将会有助于植物的培育，进而给企业带来更多经济效益。

李依民等对铁皮石斛中4个CIPKs编码基因鉴定与分析，发现DoCIPK1基因在叶和茎中的数量非常接近，但在根中的数量较多；研究还发现，DoCIPK3转录本在茎和根中的丰度是叶中的数倍；另外，DoCIPK2与DoCIPK4的表达模式趋同，二者在茎、叶中的数量接近，但在根部的数量较多。该研究为后续探讨基因在石斛生理适应中的分子功能创造了条件。铁皮石斛植物的形态发生过程历经种胚活化以及原球茎的形成、成熟与退化等时期，总体上可以分为8个不同发育时期，即种胚活化突破种皮、原球茎形成、原分生组织形成、顶端分生组织形成、椭球形原球茎、叶原基维管系统形成、根端分生组织形成、原球茎退化和苗的形成。

安红强等克隆铁皮石斛泛素结合酶基因DoUBC24，然后采用先进技术检测并分析其蛋白结构特征和进化关系，进而确定该基因的时空差异表达情况，最终得出基因在植株生长过程中所起的作用。qRT-PCR分析显示，该基因在植株叶原基维管系统形成、原球茎退化阶段的表达显著下调，相反地，其在椭球形原球茎、根端分生部位含量较多；基因在各部位中含量由高到低依次为花>茎>种子>根>叶。铁皮石斛泛素结合酶DoUBC24基因在铁皮石斛原球茎不同发育阶段的数量各不相同，故有研究人员认为该基因参与了原球茎发育过程。

安红强收集并整理了原球茎时期转录组数据，并筛选了26个表达最稳定的基因进行测试。之后经过一系列的分析，最终选取19个基因作为候选内参基因，在其研究中主要是使用geNorm等方法。

范静等经过长期研究后，发现DoTrxL2在石斛原球茎不同发育时期、不同组织中均有表达差异，具体表现为，这类基因于原球茎形成早期表达量较高，由此推测其参与了原球茎形成过程；其在种子和花中数量较多，推测该基因参与了植物生殖发育过程。

安红强等采用RT-q PCR分析表明，DoEMB8在原球茎不同发育时期表达量较为恒定，在PLB(Protocorm like body)中的表达量较原球茎不同时期要高。进一步的研究结果表明，该基因在种子中的表达量最高，是根中的数倍，这意味着其在胚胎发育阶段稳定且高表达，因而推测这类基因能够促进植物胚胎发育。魏明等经过深入的研究，揭示了兰科菌根真菌对石斛光合作用的影响机理，由此得出的结论是，兰科菌根真菌能够一定程度的加快石斛幼苗发育，这是因为菌根提升了植物中pepc基因的数量，这对于人工种植铁皮石斛、提升其产量具有重要意义。

4 总结

本研究对不同栽培模式全生长季节的铁皮石斛以及不同组织部位通过表型、理化数据分析，研究铁皮石斛在不同生境中生长的差异形成机理；铁皮石斛品质相关物质的系统性研究。通过综述对铁皮石斛各生育期关键组织，对不同发育时期林下铁皮石斛品质进行比较，以期能系统全面地解析铁皮石斛在不同种植模式下的全季节发育期的分子功能和调控机制，筛选出重点代谢通路或者基因、代谢产物等，以期后续对林下铁皮石斛进行成分代谢变化和分子机制变化研究。