猪A群轮状病毒HuB2020株的分离与基因型分析

耿 超，赵红梅，梁 婉，杨克礼，郭 锐，袁芳艳，刘 威，高 婷，刘泽文，陆泓宇，高 扬，周丹娜，田永祥

（1.湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064；2.长江大学动物科学学院，荆州 434025）

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是含有11个双链RNA的双股RNA病毒，可引起仔猪精神烦躁，呕吐、厌食以及严重腹泻等症状。此外，PoRV引起仔猪小肠病变，出现水样腹泻，引起仔猪生长缓慢的同时，还可以导致高死亡率[1]。PoRV含有多种血清群，尤其是A群轮状病毒，最为常见且为人畜共患的腹泻病毒[2]。因此PoRV的研究对仔猪腹泻病毒的防治以及人类公共卫生的提升具有重要意义。2015年，Rotavirus Classification Working Group在第7次会议上谈论研究了最新分类方法，根据外衣壳蛋白VP 6（85%）和VP7（80%）的基因序列，I基因型可以分为21个，G基因型可以分为28个。本研究分离得到一株PoRV，并对其外衣壳蛋白的基因型进行遗传进化分析，为PoRV疫情的控制提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料病料：7份病死仔猪的小肠样采集于湖北省某腹泻发生猪场，PoRV检测有1份为阳性，TGEV和PEDV检测均为阴性；MA-104细胞，保存于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室；DL2000 DNA marker、2×Phanta Max Master Mix，购自Vazyme公司；胎牛血清（FBS）、MEM培养基、0.25%胰酶，购自Gbico公司；琼脂糖，购自北京索莱宝科技有限公司； RNA提取试剂盒，购自Axygen公司；反转录试剂盒，购自Thermo公司。

1.2 病料的处理与检测将采集的病料剪取合适大小用组织破碎仪27次/s破碎10 min，然后12 000×g离心5 min取上清，提取病毒基因组，运用多重RT-PCR的方法进行鉴定。用0.22 μm微孔滤膜将PoRV为阳性的组织破碎样品过滤除菌。

1.3 病毒的分离及纯化取处理过的病毒液在胰酶作用下活化1 h，接种至清洗过的MA-104细胞，37℃孵育2 h，弃掉上清，加入含的胰酶DMEM培养基6 mL，待细胞出现明显细胞病变的时候，超低温冰箱中冻融3次分装备用。使用噬斑试验，利用MA-104细胞纯化F10代的病毒液。

1.4 分型基因的克隆参考NCBI网站上公布的PoRV的VP6和VP7基因序列，用Primer 5.0设计引物（表1）。提取PoRV分离株的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照产物纯化试剂盒说明书，纯化目的条带，进行T载体克隆，得到重组阳性质粒，送擎科生物科技（武汉）有限公司测序。

表1 VP6和VP7基因扩增引物Table 1 Sequencing of VP6 and VP7 genes

1.5 基因型鉴定与序列分析登录GenBank网站，下载PoRVVP6和VP7基因的的代表性序列，运用MegaⅩ绘制遗传进化树，将HuB2020株的VP6和VP7基因与不同类型的基因进行对比分析。

2 结果

2.1 病毒的分离及纯化将RT-PCR检测为阳性的病料接种至MA-104细胞后，分离得到一株能够使细胞出现皱缩呈神经网状并大量死亡脱落等明显的细胞病变（图1）。经过RT-PCR检测，试验成功分离得到一株PoRV，命名为HuB2020株。将HuB2020株F10代病毒液通过挑斑进行纯化（图2）。

图1 HuB2020分离株于24 h在MA-104细胞上的病变情况(100×)Fig.1 Lesions of HuB2020 isolate on MA-104 cells at 24 h(100×)

图2 HuB2020分离株噬斑图片Fig.2 HuB2020 isolate plaque picture

2.2 分型基因的克隆使用HuB2020分离株传代至F10代的基因组为模板，通过RT-PCR方法扩增得到VP6和VP7基因的目的条带，长度分别为1194 bp和981 bp（图3）。将VP6和VP7基因的产物纯化，测序得到基因序列。

图3 VP6和VP7基因的RT-PCR扩增结果Fig.3 Products of VP6 and VP7 gene by RT-PCR

2.3 PoRV VP6基因分析PoRVVP6基因是具有群特异性的中间层衣壳蛋白，决定病毒的I基因型，核苷酸同源性大于85%可认定为同一基因型。遗传进化分析结果显示（图4），分离株VP6基因与猪A型轮状病毒DZ-1（KT820766.1）和WF-5-1（KT820774.1）的同源性最高，分别为97.82%和97.32%。HuB2020分离株与I5型核苷酸同源性均大于80%，由此可知基因型相同，为猪A群轮状病毒。

图4 PoRV VP6基因遗传进化分析Fig.4 Analysis of genetic evolution of PoRV VP6 gene

2.4 PoRV VP7基因分析PoRV G基因型由VP7基因决定，若核苷酸同源性大于80%可认定为同一基因型。遗传进化分析显示（图5），分离株VP7基因与轮状病毒株HLJxf（JX498950.1）和SWU-1C（MK410283.1）的同源性最高，分别为94.39%和95.51%。HuB2020分离株与这几株毒（G9型）核苷酸同源性均大于80%，因此，其基因型为G9型。

图5 PoRV VP7基因遗传进化分析Fig.5 Analysis of genetic evolution of PoRV VP7 gene

3 讨论

本研究分离获得一株命名为HuB2020的猪A群轮状病毒毒株，获取其VP6和VP7基因序列，进行遗传进化分析，HuB2020分离株属于PoRV A群G9P[X]。中国流行的PoRV G基因型有G9、G11、G2、G4、G5、G26和G3，以G5、G9为主[3-4]。近几年，王璐等[5]研究发现G5与G9型可导致婴幼儿腹泻，在人与动物中重排会产生新的基因型。冯力等[6]发明了猪腹泻病毒的三联活疫苗，我国猪轮状病毒的G5型得到了有效控制。但是，中国及亚洲其他地区的仔猪腹泻样品中有越来越多的G9型轮状病毒被分离出来[7-10]，这也证明了G9型在我国及亚洲其他地区呈现逐年增多的趋势。苗艳等[11]通过调查也发现G5亚型在疫苗的选择压力下逐渐减少，G9亚型慢慢兴起。

随着G9基因型的兴起，无疑会加大猪轮状病毒的防控压力，HuB2020分离株（G9亚型）是中国目前的新流行株，对其遗传进化关系进行研究，将进一步了解G9亚型在我国的流行趋势，此外，轮状病毒疫情的控制需要与流行株相匹配的疫苗株，研究HuB2020分离株的特性，将为轮状病毒疫情的控制提供技术储备。