基于网络药理学及实验验证探究廖氏化风丹抗白血病活性

黄丽荣，程莎，侯菁，余佳，宋玉，万小青，滕彩厚，徐应江，骆衡（.贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 5500；3.贵州省天然产物研究中心，贵州 贵阳 5500；.贵州万胜药业有限责任公司，贵州 遵义 563005）

廖氏化风丹为“中国四大古方名药”之一，其组方由药母、紫苏叶、僵蚕、全蝎、天南星、苍术、雄黄、硼砂、巴豆霜、人工麝香、冰片、天麻、荆芥、檀香、朱砂等20 余味药物组成，其中药母由牛胆汁、白附子、生半夏、生天南星、生川乌、郁金、神曲等中药按比例混匀、发酵、风干制得[1]。廖氏化风丹应用已有300多年历史，临床上主要用于治疗中风、癫痫、急性脑梗死、面神经麻痹、脑萎缩等脑部疾病，疗效显著[2-5]。目前关于廖氏化风丹的研究与应用主要局限于脑部疾病，且其发挥药效的物质基础及作用机制尚不明确，关于其新的药效作用的研究鲜有报道。

开发传统中药的新治疗作用对于传统中医药发展具有重要意义[6]。由于传统复方中药成分复杂，进行系统性药理作用机制研究存在较多困难[7]。网络药理学从药物和疾病间相互作用的整体性和系统性出发，构建“药物-靶标-疾病”多层次网络联系，将其应用于成分复杂、靶点多、作用途径多的复方中药的研究，可系统发掘潜在活性成分和作用靶点，已成为中药走向现代化新的研究方法和技术手段[8]。

白血病是血液系统常见的恶性肿瘤，是我国十大高发肿瘤之一[9]。中医认为白血病为虚症，分为肝肾阴虚、脾肾两亏等类型，中医常用的治疗方法为柔肝和阴、化痰通络、凉血解毒等[10]。廖氏化风丹组方中的僵蚕、天南星、白附子、半夏等几味中药具有清热解毒、化痰散结等功效[11]，且已有研究证实全蝎[12]、天南星[13]、雄黄[14]、半夏[15]具有抗白血病活性，据此推测廖氏化风丹可能对白血病有一定的疗效。因此本研究拟利用GC-MS（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，气相色谱-质谱联用仪）分析廖氏化风丹的化学成分，并结合网络药理学平台补充其有效成分，预测药物成分作用于白血病的关键靶点及信号通路，构建药物成分-疾病靶点-通路网络，对核心活性成分与关键靶点进行分子对接，预测其作用机制，并通过细胞实验和动物实验初步验证廖氏化风丹抗白血病活性，以期为充分挖掘廖氏化风丹的药用价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物人红白细胞白血病细胞HEL、人慢性髓原白血病细胞K562 细胞株均来自贵州省中国科学院天然产物重点实验室。SPF 级BALB/c 小鼠雄雌各半，48 h日龄，平均体质量2.0 g，购于北京维塔河实验动物科技有限公司，动物质量合格证号：110322230101250264，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养于贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室洁净动物房，利用智能IVC 系统进行饲养，饲养环境温度为22～26 ℃，相对湿度50%～60%，换气次数为15～20 次·h-1，12 h/12 h 明暗交替。实验经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：2304908。

1.2 药物及试剂廖氏化风丹购自遵义万胜药业有限责任公司，产品批号：180504。RPMI-1640 培养基，美国Gibco 公司，批号：11875093；胎牛血清，美国BI 公司，批号：04-007-1A；青链霉素混合液（100×）、MTT试剂、PBS缓冲液，北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：P1400、IM0280、P1020；胰蛋白酶，美国Hyclone 公司，批号：SH30236.01；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，美国BD公司，批号：556547；甲醇、二甲基亚砜（DMSO）均为色谱纯，羧甲基纤维素钠（CMC-Na），德国默克公司，批号分别为：34860、276855、419338。

1.3 主要仪器HP6890/5975C GC/MS 联用仪，美国安捷伦公司；Heracell VIOS 160i 型CO2细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific；ELx808 多功能酶标仪，美国Biotek公司；FACSCanto II流式细胞仪，美国BD公司；XS-1000i五分类血细胞分析仪，日本希森美康；XPR504S/AC 型电子天平，德国梅特勒公司。

1.4 GC-MS 检测廖氏化风丹化学成分取廖氏化风丹5.0 g，研细，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容，室温下超声处理1 h（功率250 W，频率50 Hz），冷却，用甲醇补足定容，摇匀，0.22 μm 过滤膜过滤，取滤液进行GC-MS 检测。色谱条件如下：色谱柱为HP-5MS（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）弹性石英毛细管柱。柱温45 ℃（保持3 min），以4 ℃·min-1升温至250 ℃，运行时间45 min；载气为高纯度氦气，汽化室温度为250 ℃；柱前压7.16 psi，载气流量1.0 mL·min-1；进样量2 μL，分流比为40∶1，溶剂延迟时间2 min。质谱条件：离子源为ESI 源，接口温度为280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，倍增器电压1 352 V，质量范围29～450 amu。

1.5 网络药理学研究方法

1.5.1 廖氏化风丹活性成分及靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索廖氏化风丹组方药物巴豆霜、白附子、半夏、冰片、苍术、川乌、荆芥、檀香、天南星和紫苏叶的化学成分，根据药物代谢动力学（ADME）以口服生物利用度（OB）≥ 30%和类药指数（DL）≥0.18 为标准，选取药物的活性成分。TCMSP 数据库没有收录的药物僵蚕、全蝎、人工麝香和天麻，查阅相关文献检索其主要活性成分[11，16-19]。将以上获得的活性成分与GC-MS 检测获得的化学成分合并剔重，导入有机小分子生物活性数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得成分的Canonical SMILES号，将其导入在线靶标预测网站Swiss Target Prediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/）检索成分的潜在作用靶点。矿物药硼砂、雄黄和朱砂尚不能通过上述数据库进行检索获得作用靶点，因此本研究未探讨此三味药物的有效成分和靶点。

1.5.2 活性成分作用于白血病相关靶点的筛选 通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、CTD数据库（http://ctdbase.org）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http://www.omim.org/）检索白血病相关靶点，将3 个数据库获取的靶点基因通过Uniprot 标准化后合并剔重，即得到白血病靶点基因。利用韦恩平台绘制药物有效成分的靶点和疾病靶点的韦恩图，交集基因即为廖氏化风丹有效成分作用于白血病的靶点基因。

1.5.3 PPI 网络的构建与核心靶点分析 为进一步明确廖氏化风丹潜在靶点与白血病靶点之间的相互作用关系，将筛选得到的共有靶点导入STRING数据库（https://string-db.org），设置蛋白种类为“Homo sapiens”，以互作综合得分（interaction score）≥0.9 作为筛选条件，建立药物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。利用Cytoscape 3.8.0软件进行可视化处理，通过CytoHubba插件以连接度值（degree）≥2 倍中位数为条件进行拓扑分析，筛选出排前10位的核心靶点基因，用于后续的分析。

1.5.4 药物-成分-靶点网络的构建与关键活性成分分析 为进一步预测廖氏化风丹中发挥抗白血病作用的活性成分，运用Cytoscape 3.8.0软件构建廖氏化风丹活性成分与抗白血病核心靶点进行关联网络，进而分析关键的抗白血病活性成分。

1.5.5 基因功能与通路富集分析 为说明药物的靶点在基因功能中的作用，将廖氏化风丹活性成分与白血病的核心靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov），设定物种为“Homo sapiens”进行GO富集与KEGG 通路注释分析。所得结果以P≤0.05 临界值进行筛选，对结果分别进行可视化。

1.6 分子对接将获得的活性成分与核心靶点进行分子对接。通过SMILES 网站下载核心成分的mol2 格式；根据关键靶点对应的UniProt ID 在PDB 数据库（https://www.rcsb.org/structure）下载其3D结构pdb格式文件；利用PyMOL 软件对下载的靶蛋白进行除水、加氢等处理后，与核心成分mol2 格式一起导入AutoDock 转换为pdbqt文件。设置对接活性口袋，使用AutoDock 标准对接程序进行核心成分与关键靶点的对接打分。最后选择亲和力较好的结果用PyMOL软件进行可视化处理。

1.7 细胞实验验证

1.7.2 廖氏化风丹对白血病细胞凋亡的影响 取对数生长期的K562 和HEL 细胞以2×105个·mL-1浓度接种于6 孔培养板中，培养4 h 后加入浓度为10 μg·mL-1的药物，同时设溶媒DMSO对照组。继续培养48 h后分别收集细胞，用不含EDTA-Na2的胰蛋白酶消化离心并收集细胞。用4 ℃预冷的PBS 清洗2 遍，以1 000 r·min-1离心（离心半径9.5 cm）5 min。以1×Binding Buffer 重悬细胞，加入5 μL FITC 和5 μL PI试剂，混合后室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪对细胞凋亡进行测定。

1.9 统计学处理方法每项试验至少重复3次，使用SPSS 10.0软件进行数据统计分析，结果以均数± 标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 廖氏化风丹成分分析结果采用GC-MS 测定分析了廖氏化风丹甲醇提取物的化学成分，总离子流色谱图见图1。从中分离出86 个色谱峰，经NIST 谱图库进行检索解析，确定了50 个化合物的结构，占提取物总量的98.01% ，结果见表1。提取物中含量较高的化合物对应色谱图中强度较高的峰，分别为：Cholic acid（胆酸）、Atractylenolide Ⅱ（白术内酯Ⅱ）、Bufalin（蟾毒灵）、3-[（Carboxycarbonyl）amino]-Lalanine（三七素）。

2.2 活性成分及靶点的筛选、PPI 网络的构建结合GC-MS 成分分析、TCMSP 数据库检索及相关文献检索，补充一些OB、DL值较低，但经药理学研究表明其对人体仍有药理活性的成分，如天麻素[21]、木兰花碱[22]、迷迭香酸[23]等，最终分析出廖氏化风丹活性成分共111 个。通过Swiss Target Prediction 平台检索获得活性成分潜在基因1 170个。通过GeneCards、CTD和OMIM 数据库检索，通过Uniprot 标准化后合并剔重获得白血病相关基因16 946 个。将活性成分靶点与白血病相关靶点取交集，最终获得廖氏化风丹治疗白血病的潜在靶点970 个。将交集靶点上传至STRING 数据库，分析PPI 网络，由969 个节点和8 777 条边组成，平均节点为18.1。依据相关拓扑参数筛选出排前10的核心靶点，见表2。

2.3 药物-成分-靶点网络的构建为进一步分析廖氏化风丹中发挥抗白血病的关键活性成分，应用Cytoscape 软件将10 个核心靶点与13 味药物、111 个活性成分进行关联，构建了药物-成分-核心靶点网络（见图2）。结果表明10 个核心靶点共连接了48 个关键活性成分（见表3），这些成分关联到的药物分别是荆芥、全蝎、紫苏叶、僵蚕、半夏、人工麝香、天南星和天麻。据此可推测廖氏化风丹组方各味药通过多成分、多靶点协同发挥抗白血病活性。

图2 廖氏化风丹组方药物-活性成分-核心靶点网络图Figure 2 The network of Liaoshi Huafeng Dan prescription drugs-active ingredients-core targets

2.4 GO 富集分析与KEGG 通路注释将筛选得到的10个核心靶点进行GO富集分析，通过3个不同水平：生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC），根据P值升序选择前20 个通路进行排列筛选，分别得到9、3、8条生物功能信息，见图3。结果表明交集靶点在生物过程中主要参与蛋白磷酸化、细胞凋亡、细胞增殖的调控等过程；分子功能中主要涉及蛋白质结合、ATP 结合、蛋白激酶活性的调节等功能；细胞组分中主要分布于胞浆、细胞质膜等部位。将交集靶点进行KEGG通路注释分析，按P值升序排列，选取前20 个KEGG 通路制气泡图，结果见图4。结果表明廖氏化风丹与白血病相关的核心靶点可能参与的信号通路主要有：cAMP信号通路、癌症通路、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路等。基于以上结果可以推测廖氏化风丹可能通过复杂的多途径协同机制发挥抗白血病作用。

图3 廖氏化风丹抗白血病核心靶点的GO 生物功能富集分析Figure 3 GO enrichment analysis of the anti-leukemia core targets of Liaoshi Huafeng Dan

图4 廖氏化风丹抗白血病核心靶点的KEGG 通路富集分析Figure 4 KEGG enrichment analysis of anti-leukemia targets of Liaoshi Huafeng Dan

2.5 成分-靶点分子对接选取度值较高的3 个核心靶点和其对应的3个关键活性化合物进行分子对接验证，结果见表4，分子对接可视化图见图5。根据分子对接原则，结合能小于0，表明受体与配体能自发结合。结合能绝对值越大，受体与配体结合能力越强，对接后分子的稳定性越高。结果可知3个化合物与3 个关键蛋白的结合能均小于-4 kcal·mol-1，表明化合物与关键靶点均有较强的结合能力。

表4 廖氏化风丹抗白血病关键活性成分与关键靶点分子对接结果Table 4 Molecule docking results for the key active ingredients and the core targets of Liaoshi Huafeng Dan against leukemia

2.6 廖氏化风丹对K562 及HEL 细胞增殖的影响MTT法检测廖氏化风丹对K562 和HEL 细胞增殖的影响，结果如图6。廖氏化风丹在5、10、20、40 μg·mL-1时能明显抑制K562及HEL细胞的增殖（P＜0.01），且抑制率随浓度增大而提高。廖氏化风丹对K562及HEL细胞的IC50分别为（12.87±2.12）、（9.56±1.35）μg·mL-1。以上结果表明廖氏化风丹能明显抑制HEL和K562细胞的增殖。

图6 廖氏化风丹对HEL 及K562 细胞增殖的抑制作用（±s，n=5）Figure 6 Inhibition of HEL and K562 cell proliferation by Liaoshi Huafeng Dan（±s，n=5）

2.7 廖氏化风丹对K562 及HEL 细胞凋亡的影响以浓度10 μg·mL-1的廖氏化风丹分别处理HEL 和K562 细胞48 h 后，细胞凋亡情况及凋亡率如图7所示。与对照组（DMSO）比，经药物处理的HEL 及K562 细胞凋亡率为（53.0±4.6）%及（31.4±2.9）%，凋亡率明显增加（P＜0.01）。表明廖氏化风丹能够诱导HEL和K562细胞凋亡。

图7 廖氏化风丹对HEL 和K562 细胞凋亡的影响（±s，n=3）Figure 7 Effect of Liaoshi Huafeng Dan on the apoptosis of HEL and K562 cells（±s，n=3）

2.8 廖氏化风丹抗白血病的体内研究结果廖氏化风丹体内活性研究实验小鼠发病情况如表5所示。模型组小鼠集中于给药40 d 后出现白血病晚期指征，体质量明显下降，食欲锐减，弓背，耳朵发白。模型组小鼠发病数明显高于正常对照组，平均生存时间明显低于正常对照组（均P＜0.01），说明造模成功。廖氏化风丹组小鼠发病数明显低于模型组，且平均生存时间明显高于模型组（均P＜0.01），表明廖氏化风丹能明显延长红白血病小鼠生存期。

表5 廖氏化风丹抗白血病活性研究实验小鼠的发病情况（±s）Table 5 The incidence of experimental mice of Liaoshi Huafeng Dan against leukemia（±s）

表5 廖氏化风丹抗白血病活性研究实验小鼠的发病情况（±s）Table 5 The incidence of experimental mice of Liaoshi Huafeng Dan against leukemia（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

平均生存时间/d＞90 40.2 ± 9.5**＞90##分组正常对照组模型组廖氏化风丹组鼠数/只5 5 5发病数/只0 5**0##

实验小鼠脾脏形态、脾脏系数及血细胞比容如图8所示。结果表明模型组小鼠发病时脾脏高度肿大（见图8-A）；廖氏化风丹组小鼠血细胞比容明显高于模型组对照组（P＜0.05，见图8-B），其脾脏系数明显低于模型组（P＜0.01，见图8-C）。体内实验结果表明廖氏化风丹对小鼠红白血病有明显治疗作用。

图8 廖氏化风丹对白血病小鼠脾脏及血细胞比容的影响（±s，n=5）Figure 8 Effect of Liaoshi Huafeng Dan on spleen and hematocrit in leukemia mice（±s，n=5）

3 讨论

本研究采用GC-MS 分析及网络药理学方法和分子对接探讨廖氏化风丹治疗白血病的可能有效成分及潜在作用机制，并通过细胞和动物体内实验验证其抗白血病活性。结果筛选出廖氏化风丹活性成分111个，与白血病相关的关键活性成分48个，主要来源于处方中的8味药材，与白血病相关的靶点970个，主要涉及的信号通路20 条，并证明其具有明显的抗白血病活性。

中药复方制剂通过处方中各味药合理的配伍，达到纠正其偏性，消除或降低其毒性，增强其疗效等目的，以发挥处方中各药间相辅相成的综合作用。廖氏化风丹处方由20 余味药材组成，药母运用发酵工艺制备，药材原成分可能发生生物转化，使得药物成分更加复杂。因此，运用色谱分析廖氏化风丹的化学成分较数据库检索更加科学准确。本研究筛选得到的抗白血病关键活性成分主要来源于荆芥、全蝎、紫苏叶、僵蚕、半夏、人工麝香、天南星和天麻8 味药材。半夏提取物能有效抑制髓系白血病、T淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进其凋亡，其作用机制可能与其调节Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达有关[15]；以全蝎为主药的全蝎解毒汤联合化疗治疗急性白血病效果明显[17]；天南星甲醇提取物能够抑制K562 细胞增殖[24]；紫苏叶通过死亡受体介导、线粒体和内质网应激诱导途径联合诱导人白血病HL-60细胞凋亡和g1 期阻滞[25]。由此可推测，这几味药是廖氏化风丹发挥抗白血病活性的重要组成部分。在筛选得到的48 个关键活性成分中，千层纸素A 能够诱导K562 细胞凋亡，可能与下调survivin 蛋白表达，激活caspase-9 蛋白，抑制ERK 信号通路有关[26]；有研究[27]通过细胞实验和小鼠体内实验证明野黄芩苷具有抗急性髓系白血病活性，与调控JNK/caspase-3 信号通路有关；芹菜素诱导人白血病细胞凋亡，通过诱导Akt 失活导致JNK 激活并最终导致caspases 激活[28]；木樨草素作为一种新型p90核糖体S6激酶抑制剂，可明显抑制白血病细胞的增殖和迁移[29]；槲皮素能明显诱导人白血病细胞U937 凋亡，其作用机制与下调Mcl-1、survivin 和XIAP 有关[30]；芝麻素能够明显抑制白血病细胞MOLT-4和NB4生长并促进细胞凋亡，与其能明显增加caspase-3、-7、-8及-9基因的表达，下调BCL-2 的表达有关[31]；蟾毒灵能明显抑制白血病细胞HEL 的增殖，诱导细胞凋亡，与下调WT1基因的表达水平有关[32]。以上表明这些成分可能是廖氏化风丹抗白血病活性的重要物质基础。

通过蛋白互作分析得到ABL、BCL-2、KIT、TP53、MAPK3、AKT1、PIK3R1 等核心靶蛋白，这些蛋白为cAMP、PI3K-Akt 等信号通路中的关键蛋白。其中ABL、KIT与BCL-2是治疗白血病的重要靶点，BCR-ABL、KIT 抑制剂伊马替尼（格列卫）以及BCL-2 抑制剂维纳妥拉是治疗白血病的临床一线药物[33]。PIK3R1、Akt1等是PI3K-Akt-mTOR 信号通路上的主要靶点，与控制白血病细胞的增殖和凋亡有密切关系[34]。通路富集结果可知廖氏化风丹抗白血病主要通路有cAMP信号通路、癌症通路、神经活性配体-受体相互作用及PI3K-Akt 信号通路。cAMP 信号通路易被许多类型的细胞毒性损伤激活，进而调节细胞增殖、转移和凋亡等功能[34-35]。PI3K-Akt通路是癌症最常见的激活途径，癌细胞中PI3K-Akt 通路的致癌激活通过增加营养转运体和代谢酶的活性来重编程细胞代谢，从而支持异常生长细胞的合成代谢需求[36]。以上结果进一步表明廖氏化风丹具有潜在抗肿瘤活性。分子对接结果显示廖氏化风丹中化合物野黄芩苷、巴利森苷C 及千层纸素A 与核心靶点ABL、BCL-2及KIT有较强的亲和力，预测这些成分可能与白血病关键靶点发生相互作用。

通过细胞实验证实了廖氏化风丹可有效抑制K562 及HEL 细胞增殖，呈浓度依赖性；处理48 h后，细胞凋亡率明显增加。动物体内实验进一步证实了廖氏化风丹对小鼠红白血病有明显治疗作用，表明了本研究中系统药理学分析结果的可靠性。

综上所述，廖氏化风丹具有抗白血病活性，其可能通过多成分协同作用，多途径、多靶点作用机制发挥药效。本研究为廖氏化风丹抗白血病有效成分的筛选、作用机制研究及临床应用提供了参考，为拓展廖氏化风丹的临床应用提供了依据。