氟暴露对线粒体损伤的研究概况

郭东光,张凯波,邱骏峰,陈明艳

(新乡学院生物工程学院/动物疫病分子诊断河南省工程实验室,河南新乡 453000)

氟中毒已是一个严重的公共卫生问题,据报道每天口服0.15 mg/kg氟化物可能会发生不良反应[1]。成年人摄入16～64 mg/kg氟化物后会导致死亡,儿童摄入3～16 mg/kg氟化物即可致命。相关研究报道,全球约有2亿人氟化物摄入量超过了世界卫生组织(World health organization,WHO)推荐的1.5 mg/L水平。中国和印度是受氟影响最为严重的国家之一,地下水中的氟浓度可高达48 mg/L。氟化工业废水含量为96.8 mg/L,特殊情况下可达到3 000～5 000 mg/L[2]。

线粒体是细胞的主要供能细胞器,与调控真核细胞的生理功能密切相关[3]。在能量代谢、细胞凋亡、细胞分化、细胞信号转导和铁代谢中发挥重要作用。大量研究表明,机体长期接触氟或吸收异常浓度的氟后可导致细胞发育不良,降低细胞增殖和分化能力,进而引发线粒体功能障碍,如干扰呼吸链复合体的表达,通过产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)、促炎信号或线粒体膜通透性增加等引起细胞损伤或凋亡这些变化均与细胞线粒体超微结构的破坏密切相关[4]。同时,因线粒体功能障碍也打破了组织中氧分子的稳态平衡,导致正常的细胞生物学过程破坏,进而引发基因损伤和生物功能障碍,也是引发细胞凋亡和损伤的重要因素[5]。因此,本文主要讨论氟对线粒体损伤的影响,主要阐述了其具体作用途径和分子机制,为预防和控制氟污染提供理论依据和参考。

1 线粒体障碍与细胞凋亡

线粒体是细胞凋亡途径的核心,参与该通路的有3种关键蛋白类型,即B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)家族蛋白、半胱氨酸天冬酶(cysteine-aspartic acid proteases,caspase)和线粒体促凋亡蛋白。此外,作为氧化应激的信号,细胞内ROS水平的升高,也可以激活细胞凋亡信号通路。一旦凋亡刺激信号发生,过量的ROS产生有助于大分子氧化,导致自由基攻击膜磷脂,随后通过诱导脂质过氧化、线粒体膜去极化等导致膜损伤[6]。

线粒体既是ROS的目标,也是细胞内ROS产生的主要来源。一方面细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)的释放可导致ROS的产生。另外,ROS的形成也进一步打开了线粒体通透性过渡孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP),破坏了线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),引发Cyt C的释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic acid protease-3,caspase-3)的裂解,最终导致细胞凋亡。此外,ROS也可以断裂DNA的单链或双链,激活DNA依赖的蛋白激酶和肿瘤蛋白53(tumor protein 53,p53),导致细胞凋亡[7]。

1.1 氟暴露后ROS积聚引发线粒体损伤及细胞凋亡

ROS的变化与细胞衰竭密切相关,氟化物的积累会导致大量ROS的产生,通过激活激酶和caspase级联,导致细胞膜氧化、线粒体、蛋白质和DNA损伤以及细胞死亡[8]。转录组分析表明,氟化钠(NaF)可增加灵芝中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的表达水平和细胞凋亡,证明cAMP在线粒体诱导的细胞凋亡中发挥重要作用[9]。Yan X等[10]报道NaF通过调节线粒体途径,如降低MMP和ROS增加,对H9C2心肌细胞产生毒性作用进而引发细胞凋亡。此外,氟可以显著提高人甲状腺细胞、脐静脉内皮细胞和肾组织中的ROS水平,从而导致氧化应激和细胞凋亡。另外,长期暴露于高剂量的氟化物可导致大鼠肾脏中膜脂的改变和过氧化,诱导肝脏氧化应激,导致肝细胞凋亡[6]。在猪肝脏中的研究也表明,氟暴露后导致线粒体功能障碍,通过上调氧化应激水平、诱导脂质过氧化,激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cysteine-aspartic acid protease-9,caspase-9)和caspase-3来诱导细胞凋亡[11]。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)时一种神经退行性疾病,与β-淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)的形成密切相关。研究显示,Aβ可导致渐进性突触损伤,破坏线粒体电子转移链,增加ROS产生,进而引发细胞凋亡[12]。此外,作为脑中的免疫细胞,当小胶质细胞当受到异常刺激、神经毒性物质、感染或损伤时,会形成促炎细胞因子,如白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-Α,TNF-α)等,与ROS一起诱发神经炎症和神经退行性病变[13],进而引发细胞损伤或细胞凋亡。

1.2 氟暴露后线粒体外膜损伤介导细胞凋亡

线粒体外膜通透性在线粒体介导的细胞凋亡途径中发挥重要作用,其通透性增加可导致Cyt C等促凋亡蛋白从线粒体释放到细胞质,进而引发caspase激活和细胞凋亡。同时,发生在细胞凋亡之前的MMP的破坏也是由线粒体外膜通透性增加所介导的,其可以促使线粒体膜内外跨膜离子浓度梯度扩散[14]。Anuradha C D等[15]研究证实,氟化物可作为一种解偶联剂诱导Cyt C的释放的根本原因是其可以提高线粒体外膜通透性。作为线粒体介导细胞凋亡的先决条件,MMP与Bcl-2家族蛋白重组密切相关。Yang S等[16]发现NaF可通过降低成骨细胞中Bcl-2 mRNA表达,提高Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)mRNA表达,进而增加线粒体外膜通透性,激活线粒体凋亡信号转导通路。因此,线粒体膜通透性的增加是氟诱导细胞凋亡发生的必要条件,而MMP的破坏是线粒体外膜通透增加的重要因素。因此,大量ROS积累改变线粒体外膜通透性,激活线粒体介导的凋亡途径,最终导致细胞凋亡[17]。

2 氟暴露后的内源性细胞凋亡途径

2.1 氟暴露后线粒体膜电位破坏介导的Caspase级联反应引发细胞凋亡

细胞或组织中过多的脂质过氧化物积累会破坏MMP,促进线粒体中促凋亡蛋白的释放,包括Cyt C、caspase的第二线粒体半胱氨酸蛋白酶活化因子/直接抑制凋亡结合蛋白(second mitochondrial activator of caspases/direct inhibitors of apoptosis binding protein with low pI,Smac/Diablo)、丝氨酸蛋白酶高温需求蛋白A2/Omi(serine protease high-temperature-requirement protein A2/Omi,HtrA2/Omi)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸内切酶G(endonuclease G,Endo G)等[18]。当Cyt C从膜间隙释放到细胞质后,可以启动caspase凋亡依赖通路,结合凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor,Apaf-1)和半胱氨酸蛋白酶-9(procaspase-9)构成凋亡小体,促进caspase-9的激活。然后,激活的caspase-9裂解并激活下游的caspase-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6(cysteine-aspartic acid protease-6,caspase-6)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7(cysteine-aspartic acid protease-7,caspase-7),导致裂解的聚腺苷酸核糖聚合酶(cleaved poly-adp-ribose polymerase,PARP)裂解和细胞凋亡[19]。

众多的研究结果已经证实氟暴露后可以引发caspase级联反应,进而导致细胞损伤或凋亡。如氟暴露可增加大鼠肾脏和人类牙龈成纤维细胞中Cyt C蛋白表达水平和caspase级联反应。NaF还可通过提高HL-60细胞、Leydig细胞、H9C2心肌细胞、卵母细胞、人肺BEAS2B细胞、大鼠肝脏、胸腺细胞中Cyt C、caspase-3和caspase-9 mRNA或蛋白水平来诱导细胞凋亡[6]。Wang L等[20]通过免疫印迹法检测到了激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteine-aspartic acid protease-8,caspase-8)、caspase-3和PARP,并发现了其可诱导成釉细胞凋亡。在K562癌细胞系中,NaF处理后较高的PARP裂解也与细胞凋亡的发生密切相关[21]。

氟暴露后,鱼肾和猪肝细胞中caspase- 3、caspase-9和caspase-8的表达量呈剂量依赖性升高,表明氟可诱导caspase-3依赖性凋亡。在NaF处理正常大鼠肾细胞后,随着NaF浓度(0、5、20 mg/L)的增加,caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA表达也显著增加。在氟诱导小鼠肾脏细胞凋亡过程中,氟可以促进MMP的去极化,并显著提高Cyt C的mRNA和蛋白水平,增加caspase-3和caspase-9的表达水平,最终导致细胞凋亡[22]。Chen J等[23]也证实在高氟环境下,鲤鱼肾脏中caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表达显著增加。汤颖等[24]研究表明,氟浓度≥10 ppm时,能明显诱导细胞线粒体膜电位去极化,促进Cyt C从线粒体释放到胞质,促进cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3蛋白表达。RT-PCR结果同样证明,氟暴露可上调caspase-9和caspase-3的mRNA表达水平,并呈浓度依赖性,其结果证实高浓度氟通过内源性线粒体凋亡通路诱导PDLSCs细胞凋亡。

2.2 氟暴露通过Bcl-2家族蛋白调控的线粒体外膜完整性介导的细胞凋亡

Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体外膜的完整性,在线粒体介导的细胞凋亡中发挥关键作用。Bax和Bcl-2拮抗杀伤剂(Bax and Bcl-2 antagonistic killer,Bak)可以通过相互多聚化形成孔隙化合物,促使细胞凋亡。研究检测了Bcl-2家族蛋白或基因,如Bcl-2、Bcl-xL (Bcl-extra large,Bcl-xL)和Bax的表达,观察到随着氟化物诱导细胞凋亡水平的增加,Bax的表达显著增加,Bcl-2和Bcl-xL的表达显著降低[25]。如在800 μmol/L NaF的作用下,在肝癌患者的肝细胞和猪睾丸支持细胞中Bcl-2的蛋白表达显著降低,Bax的表达显著升高,说明NaF可通过内源性凋亡途径诱导细胞死亡[26-27]。

此外,研究还表明NaF可诱导大鼠卵巢细胞JNK和ERK的磷酸化,通过ERK和JNK信号通路导致Bcl-2表达减少,Bax表达增加,导致大鼠卵巢细胞凋亡。在氟处理的PC12细胞中,发现细胞凋亡水平的增加与Bax mRNA表达水平增加和Bcl-2表达水平降低密切相关[28]。然而,Lee J H等[29]在牙龈成纤维细胞中研究指出,NaF在下调Bcl-2表达时,并不改变Bax的表达水平,表明Bax与Bcl-2比值提升是细胞凋亡发生的关键。此外,已经证实氟化物通过Bcl-2/Bax信号通路诱导氧化应激导致心肌组织损伤[30]。研究还表明,MicroRNAs(miRNAs)通过抑制环氧合酶2基因(cyclooxygenase-2 gene,COX-2)来削弱Bcl-2的活性,完成Bax和Bak在线粒体表面的活化和易位,形成Bax/Bak复合体,引起线粒体膜电位的破坏和Cyt C的释放,间接参与线粒体凋亡途径[8]。

3 氟暴露后抗氧化机制紊乱介导细胞凋亡

抗氧化机制对维持机体的氧化稳态至关重要,抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)。其中,SOD主要猝灭超氧阴离子(O2-),CAT促进H2O2分解为氧和水,具有抗氧化作用[31]。当机体摄入过量氟时,会阻碍自由基清除物的合成,从而增加自由基和H2O2引起的氧化应激反应。通过对四组4 W ICR小鼠分别暴露于不同浓度的NaF (0、12、24、48 mg/kg)后42 d,结果表明NaF通过影响肝脏的抗氧化系统,可以显著增加肝脏中ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,显著降低SOD、CAT、GSH、GSH-px和GST等抗氧化酶mRNA表达水平[32]。因此,小鼠肝脏中大量的氟化物积累可降低肝脏中抗氧化酶水平引发肝细胞凋亡和氧化应激。此外,慢性氟中毒也会抑制幼鼠血液中抗氧化酶的活性,导致ROS积累[33]。在0.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和50 mg/L NaF暴露组,氧化应激相关基因[SOD、谷胱甘肽过氧化物酶基因(glutathione peroxidase gene,GPX)、线粒体钙离子运输蛋白1基因(mitochondrial calcium uptake 1 gene,MICU1)、热休克蛋白90基因(heat shock protein 90 gene,HSP90)]和脂肪酸合成相关基因mRNA表达显著下调,表明NaF不仅抑制抗氧化酶活性,还可以破坏细胞脂肪代谢[34]。由于肝脏损伤,抗氧化酶活性降低,对脂质过氧化物产物的清除能力也降低,而脂质过氧化物的积累进一步引发和加重细胞受损。

一项研究显示,在胚胎发育早期向饮水中添加氟化物会导致维生素C(vitamin C,VC)、谷胱甘肽的还原形式和氧化形式的(GSH/GSSH)比值、总蛋白含量和SOD活性降低。而脂质过氧化和氮氧化物(nitric oxide,NO)水平显著升高,诱发大脑区域氧化应激,干扰神经元的正常功能[35]。因此,氟化物可以通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进入大脑,通过诱导细胞氧化应激导致神经细胞受损。此外,氟还可促进卵巢中一氧化碳(carbon monoxide,CO)产生并促使参与氧化应激的ROS、NO和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)水平显著升高,而CAT、SOD、GSH-Px含量显著下降,进而诱发大鼠卵巢氧化应激[36]。暴露于氟化物的雌性斑马鱼的卵巢中SOD、CAT、GPX、GSH含量及其mRNA表达量显著降低,提示氟诱导卵巢氧化应激,影响卵巢发育[37]。CHEN等[38,39]报道高剂量氟能够降低抗氧化酶活性,增加氧化应激,最终诱导肉鸡法氏囊和脾细胞凋亡。贺凌飞等[40]研究显示,在一定剂量条件下,氟可引起小鼠成釉细胞氧化应激,DNA 损伤,细胞凋亡,细胞增殖周期改变和细胞增殖活性的降低,这些结果均与胞内SOD、GSH-Px、MDA变化密切相关。

4 氟暴露后线粒体融合和线粒体呼吸链传导异常介导细胞凋亡

氟中毒可引起线粒体功能障碍的主要原因之一是线粒体裂变与融合之间的平衡破坏,导致线粒体形态发生改变,进而导致线粒体功能障碍。因氟具有极强的线粒体毒性,能通过氧化应激诱导线粒体损伤,而线粒体融合(mitochondrial fusion)在补充受损线粒体DNA和维持线粒体生理功能膜电位方面具有重要作用[41]。尤其是具有膜重构特征的线粒体融合蛋白-1(mitofusin-1,Mfn1) 和视神经萎缩蛋白-1(optic atrophy 1,OPA1)可分别促进线粒体外膜和内膜的融合[42]。研究显示,肾脏中氟的积累可改变线粒体呼吸链复合体(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)的含量,而这些复合体是线粒体呼吸链的基本组成部分[43]。线粒体NADH脱氢酶呋喃核蛋白2(NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 2,mitochondrial,NDUFV2)、线粒体琥珀酸脱氢酶复合物呋喃核蛋白A亚单位(succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A,mitochondrial,SDHA)、Cyt c、氧化酶亚单位4同工酶1(cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1,mitochondrial,COX Ⅳ)是线粒体呼吸链组装和功能不可或缺的组成部分,是线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的亚基[44]。研究表明,随着氟浓度的增加,Cyt C和细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)的表达量也显著增加,Mfn1和OPA1的表达也在一定程度上显著提升,而SDHA的表达量显著降低。其结果表明,氟暴露干扰线粒体呼吸链复合体的表达,引发线粒体的异常表达和融合,导致线粒体功能障碍,影响肾脏功能[45]。

5 氟暴露引发线粒体自噬介导细胞凋亡

自噬(autophagy)是由细胞毒性刺激诱导的,细胞凋亡过程往往伴随着自噬现象的发生,多数研究表明自噬是细胞启动的自我保护机制。当自噬上调时,自噬可抑制细胞凋亡。同样,细胞凋亡也可以减少自噬。在一定条件下,自噬不仅能促进细胞生存,还能促进细胞凋亡,该过程可以调节受损或衰老的大分子和细胞器[46]。自噬主要在适应不利的生长条件或随后的细胞应激中发挥生存作用,主要参与细胞分化、发育、病原体防御、衰老、凋亡和细胞死亡等过程[47]。因此,生理条件下,自噬在细胞保护过程中发挥着重要作用。

研究显示,氟中毒后的线粒体功能障碍引发MMP降低,PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)表达水平增加,导致帕金森蛋白2/Parkin(Parkin RBR E3 ubiquitin-protein ligase,PARK2/Parkin)募集和线粒体外膜蛋白泛素化(ubiquitination),随后线粒体膜破裂和抗增殖蛋白2 (prohibitin 2,PHB2)暴露。PHB2是一种重要的线粒体内膜蛋白,可调节线粒体的组装和功能,直接结合吞噬细胞上LC3并触发自噬[48]。据报道,2.4 mmol/L NaF暴露可导致小鼠睾丸中PINK1的mRNA表达显著增加,1.2 mmol/L和2.4 mmol/L NaF组的蛋白水平显著提升,而PHB2的mRNA和蛋白表达明显低于对照组[49]。其结果表明,PINK1/Parkin通路参与了氟诱导的睾丸间质细胞自噬。研究还表明,NaF可增加大鼠海马区融合蛋白水平表达,显著降低蛋白裂变水平,提示氟可通过抑制线粒体裂变、自噬和过度凋亡导致人类阿尔茨海默病的发生[49]。

6 小结

本文就氟中毒可能引起线粒体毒性进行了综述,了解到氟中毒可破坏细胞线粒体超微结构,导致线粒体外膜通透性增加,打破线粒体裂变与融合之间的动态平衡,从而导致线粒体呼吸链的传递受阻,膜电位发生变化,引发ROS含量增加,触发容量级联反应等,这些途径相互作用,最终引起细胞凋亡或损伤,其可以作为探索氟中毒致细胞损伤的重要分子机制。然而,氟中毒的毒性机制显然是非常复杂的,对氟致细胞死亡、坏死、凋亡和细胞器功能障碍的研究仍具有重要意义。因此,深入研究氟毒性的相关机制将有助于进一步寻找限制氟暴露的途径,减少氟对人体和动物的危害。