宏基因组测序应用于SPF动物的研究进展

程文杰,谢宇潇,魏红江,赵素梅

(云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201)

实验动物是指经人工饲育,对其携带的微生物实行控制,遗传背景明确或者来源清楚的,用于科学研究、教学、生产、检定以及其他学科实验的动物[1]。实验动物按微生物学等级可分为普通级动物、清洁级动物、无特定病原体动物、无菌级动物。其中无特定病原体(specific pathogen free,SPF)动物,是指除清洁级动物应排除的病原外,不携带主要潜在感染或条件致病及对科学实验干扰大的病原的实验动物[2]。随着科学研究的不断发展,对实验动物的要求也越来越高,SPF动物和无菌动物均能满足保证实验过程质量和实验结果具有可重复性的要求,但SPF动物饲养管理成本低于无菌动物,因此,SPF动物得到更广泛的应用。常见的SPF动物有猪、猴、鼠以及虾、斑马鱼等[3]。

宏基因组学(Metagenomics)又称元基因组学、环境基因组学,最早在1998年由Handelsman J[4]提出,宏基因组学的研究对象包括环境中存在的所有微生物。传统的微生物研究需要对微生物进行分离培养,但环境中绝大部分微生物因为条件的限制无法通过分离培养获得[5]。宏基因组学则是以样品中全部的DNA为研究对象,是认识微生物多样性、种群结构和功能以及微生物与环境、疾病关系的现代技术手段。目前宏基因组学研究技术主要包括扩增子测序和宏基因组测序[6]。与扩增子测序相比,宏基因组测序灵敏度更高,在门、纲、目、科、属水平上鉴定分类群的优势明显,从而可以更好的描述微生物群落的复杂性[7]。宏基因组测序已应用于土壤、海洋、肠道微生物、临床疾病诊断等研究领域。论文就宏基因组测序应用于SPF动物,对肠道微生物多样性、病原体检测、药物作用机制及微生物与健康的关系进行综述。

1 肠道微生物多样性

宏基因组可注释样品中包含的所有微生物序列,进而可以了解微生物的种类和组成。管志伟[8]通过宏基因组测序发现SPF级SD大鼠肠道微生物群在界水平上主要由细菌界组成,约占90%;在门水平,SD大鼠肠道微生物菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和疣微菌门组成;在纲水平上,以拟杆菌纲和梭菌纲为主。Hughes E R等[9]发现SPF级C57BL/6小鼠盲肠中最丰富的两个门为厚壁菌门和拟杆菌门。Scavizzi F等[10]报道了SPF与非SPF级C57BL/6N小鼠的微生物菌群组成在门和科水平上相似,但门水平中的拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和疣微菌门以及科水平中的拟杆菌科、肠球菌科、乳杆菌科、丹毒科、螺杆菌科、阿克曼菌科、肠杆菌科、双歧杆菌科的微生物组成存在显著差异,另外SPF小鼠中缺失螺杆菌科细菌。Chen J等[11]发现环境的改变会影响小鼠肠道微生物多样性,如转移到常规设施里与普通小鼠共同饲养的SPF级C57BL/6小鼠粪便微生物中Psedomonasstutzeri与黏金黄杆菌这两种致病菌水平低于SPF级C57BL/6小鼠。

除环境外,肠道微生物的组成也受其它因素的影响。Zhao H等[12]发现切除SPF级C57BL/6小鼠卵巢后,小鼠肠道中大肠埃希氏菌、Bacteroidesuniformis、B.xylanisolvens、Parabacteroidesdistasonis等的相对丰度随时间增加、雌激素水平降低而增加,小鼠雌激素水平的降低增加了与小鼠肥胖相关的韦荣球菌属和大肠埃希氏菌的丰度。大肠埃希氏菌是一种机会性病原体,当宿主抵抗力降低时,可引起感染和炎症性肠病。因此,雌激素的减少导致大肠埃希氏菌的丰度升高可能会导致机会性感染的风险加大。Jangid A等[13]发现SPF级C57BL/6小鼠Ap1m2基因敲除组与未敲除组相比厚壁菌门、变形菌门和疣微菌门的水平升高,拟杆菌门和放线菌门水平降低;在属水平上,两组之间共有77个属的微生物发生显着变化。Rodriguez-Palacios A等[14]发现,SAMP快速老化小鼠与AKR小鼠相比在门水平上拟杆菌门相对丰都显著增加,在纲水平上拟杆菌纲与鞘脂杆菌纲的相对丰度增加。Jia L等[15]通过宏基因组测序对SPF级C57BL/6J小鼠进行研究,发现SARS-CoV-2 S DNA疫苗的免疫接种可以改变小鼠的肠道微生物群组成,小鼠肠道共生菌中拟杆菌科、普雷沃氏菌科和副拟杆菌属的丰度显著增加。Jangid A等[16]发现,可溶性纤维可以促进SPF级C57BL/6小鼠乳酸杆菌的富集,饮食中可溶性纤维的存在可能比单独的不溶性纤维更有利于肠道微生物生态,从而对宿主健康产生有益影响。以上关于肠道菌群组成及多样性的研究多采用饲育SPF小鼠以及宏基因组测序相结合的方式。饮食、饲养环境、药物等条件均可能改变微生物多样性,宏基因组测序为探究微生物多样性与环境条件的关系提供了有效手段,促进了对微生物多样性的了解。

2 病原体检测

宏基因组测序可以一次性提供样品中存在的包括宿主和微生物来源的所有核酸序列,在病原检测以及病原体特异性诊断方面有着很大优势,为疾病针对性的治疗奠定基础。Schneeberger P H H等[17]根据筛选出可能引起消化道紊乱的细菌性疾病对腹泻患者粪便样本进行宏基因组检测,发现宏基因组学能够诊断出多个多重PCR未检测到的细菌。宏基因组在人类临床样本中应用的可能性已经得到证实,在人体临床病例诊断中的应用也越来越广泛[18]。SPF动物种群对疾病净化要求高,需定期进行病原体监测。利用SPF动物作为实验对象结合宏基因组测序进行病原检测的方法也逐渐得到应用。Scavizzi F等[10]发现对普通小鼠使用宏基因组测序的方法与常规检测方法检测的结果吻合,检测出肝螺杆菌、鼠诺如病毒等14种病原,而在SPF级C57BL/6N小鼠中没有发现特定病原体,这表明应用宏基因组测序对实验动物进行健康监测可行。

动物的生产性能受到多个因素的影响,其中病原感染即使是在隐性感染状态下也会导致饲料转化率低等生产问题。病原体检测有助于养殖业疾病预防,提高动物生产性能。Zhao L等[19]从SPF级金定鸭所有样品中均检测到约300种病毒,显示出高水平的混合感染,其中有正黏病毒科、疱疹病毒科、小双节 RNA 病毒等,这些病毒在不同样品中的丰度存在差异。Blomström A L等[20]在健康的SPF猪和患有PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)的猪中均检测到了圆环病毒2型,还发现多种病原共感染。猪扁桃体病毒组特征也得到了表征,发现共存在8个病毒科,在所有猪中均发现存在腺病毒,但其常引起亚临床感染,不是引起呼吸道疾病的主要病原体,在两头SPF级约×长二元杂交猪和两头传统饲养的猪中发现了在欧洲尚未检测到的PPV7[21]。宏基因组测序能够确定病原体在动物中的流行情况,有助于研究病原体在疾病发展中的潜在作用。

猪是最有可能解决异种器官移植供体短缺问题的动物,但存在生物安全等风险。使用宏基因组测序技术检测供体SPF猪是否携带戊型肝炎病毒等人兽共患病病原,为异种器官移植受者的安全提供保障[22]。Mishkin N等[23]对来自120个机构的11 387个粪便宏基因组数据分析发现,鼠衣原体在美洲和欧洲的小鼠中普遍流行,这表明可以利用公开的宏基因组数据了解SPF级以及其它微生物学等级实验用小鼠或其它动物中特定病原体的流行情况。宏基因组测序技术在SPF动物病原监测中的应用将为SPF动物种群疾病净化和预测未来疾病的爆发提供参考,也使得对SPF动物监测的范围从病原体扩大到更广泛的微生物群监测。

3 药物作用机制

宏基因组测序技术不仅可以鉴定肠道菌群的种类和组成,还能够预测肠道菌群的功能,在探究药物作用机理方面发挥作用。中药对治疗多种疾病有良好作用,中药发挥效用的机制不断被探索。Liu Y等[24]发现化滞柔肝颗粒可以改变SPF级C57BL/6J小鼠肠道微生物的多样性、结构和功能,进而改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝,这可能是通过代谢和细胞过程发挥作用,化滞柔肝颗粒的使用增加了氨基苯甲酸降解、类固醇生物合成、倍半萜和三萜生物合成。管志伟[8]报道了加味人参乌梅汤能够使SPF级SD大鼠因腹泻导致失调的肠道菌群显著改善,中药组中乳酸杆菌属等多种益生菌的相对丰度显著高于西药组,菌群调控了营养物质代谢和转运,发挥乌梅汤的止泻作用。施丽婕等[25]研究发现化瘀通阳方可能通过富集乳酸杆菌属和Akkermansia达到治疗SPF级Wistar大鼠溃疡性结肠炎的目的。Zhang S等[26]发现参苓白术散能够改善SPF级SD大鼠功能性消化不良造成的肠道微生物群落的组成和功能失调,也从肠道微生物的角度深入了解参苓白术散治疗功能性消化不良的机制。

除传统中药外,许多西药作用机制也在SPF动物上通过宏基因组测序进行了研究。Wang R等[27]发现诺丽果改变了SPF级2型糖尿病C57BL/6J小鼠的肠道菌群组成,研究结果表明,另枝菌属、普雷沃氏菌属、乳酸杆菌属和Akkermansia的丰度增加,颤杆菌克属和脱硫弧菌属的丰度降低,并显著降低了与碳水化合物代谢、翻译、氨基酸代谢和核苷酸代谢相关的通路,分析发现诺丽果在2型糖尿病中的降血糖和降血脂活性可能归因于肝脏腺苷酸激活蛋白激酶的激活和肠道微生物群的调节。

传统动物养殖中多使用抗生素预防、治疗疾病,但会产生耐药性、药物残留等问题。全面禁抗后微生物制剂替代抗生素作为新的饲料添加剂已经成为研究热点,有关益生菌发挥抗病作用的研究报道越来越多。Zhang Q等[28]鉴定出动物双歧杆菌是对感染流感的SPF级C57BL/6小鼠具有保护作用的肠道微生物群的成员,动物双歧杆菌可能通过促进缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和辅酶A的生物合成来介导对流感的保护作用,这为抗流感益生菌制剂的发展奠定了基础。Wu F等[29]报道了副干酪乳杆菌L9和动物双歧杆菌A6降低Wistar大鼠牙周炎龈下微生物组中的链球菌属、梭杆菌属、韦荣氏球菌属和埃希氏菌属等致病菌属的相对比例,两种益生菌均显著抑制与牙周炎发病密切相关的粘附、侵袭等功能相关的细菌毒力因子水平,从宏基因组学角度证明了益生菌对口腔菌群的调节作用。Zhou D等[30]发现土壤可能作为一种潜在的"益生元",促进SPF级C57小鼠含有T3SS细菌分泌系统基因的肠道微生物的繁殖和生长,而T3SS丰度与小鼠的先天免疫功能呈显著正相关。以上结果表明药物通过调控肠道菌群的数量和功能发挥作用。宏基因组测序帮助认识药物与微生物的相关性,也为药物使用提供了科学依据。

4 微生物与健康

肠道微生物与机体健康密切相关,因此越来越多的研究通过宏基因组测序技术利用SPF动物作为动物模型探讨肠道微生物与健康的关系,这为我们了解疾病的发生和发展指引了新的方向。Hughes E R等[9]对化学诱导的结肠炎模型SPF级C57BL/6小鼠盲肠微生物进行了宏基因组测序,发现变形菌门、脱铁杆菌门和疣微菌门相对丰度增加,细菌的甲酸盐氧化和有氧呼吸是过度表达的代谢途径,呼吸脱氢酶、末端氧化酶和末端还原酶等电子传递链组分的编码基因丰度增加,与葡萄糖硫酸钠诱导的炎症有关。Jangid A等[13]发现,硫酸盐还原菌和产乳酸菌的丰度增加可能会加重结肠炎的病情,敲除Ap1m2基因的SPF级C57BL/6小鼠中氧化应激相关基因的丰度增加,而碳水化合物代谢相关基因的丰度降低,表明微生物群在炎症期间发挥维持体内平衡的作用。

以上研究从宿主发病后获取样本,未能找到有效的疾病预测因子。Miyoshi J等[31]使用抗生素处理IL-10基因缺陷SPF级C57BL/6J小鼠模型,发现抗生素处理过的雌鼠的后代出现持续功能失调的现象,这些后代发生的微生物重组与特定功能子系统的改变有关,比较发现在出现结肠炎之前,不同处理组的小鼠之间,多个功能子系统尤其是氮代谢发生了变化。宏基因组测序有助于寻找疾病发作或复发的预测因子,实现早期干预,也可成为评估风险的有效工具。

环境、疫苗、病毒等因素也会导致机体肠道微生物发生变化进而对宿主健康产生影响。Tu P等[32]发现除草剂2,4-D(2,4—二氯苯氧乙酸)处理的SPF级C57BL/6小鼠中,尿素降解、氨基酸和碳水化合物代谢等途径发生了显著变化,通过宏基因组测序进一步揭示了除草剂2,4-D毒性机制,表明环境污染物与微生物群之间的相互作用。Chen J等[11]将SPF级C57BL/6小鼠安置在常规设施中,发现肠道微生物群多样性显着增加,也调节了小鼠造血基因表达。疫苗是预防疾病的有效手段。Swaminathan G等[33]发现抗生素会破坏BALB/c小鼠肠道微生物,进而降低疫苗接种后IgG水平;研究发现,萜类-醌生物合成、硫代谢、色氨酸代谢、硒化合物代谢等4条代谢通路的富集与抗原特异性IgG滴度的降低有关。Jia L等[15]证明了不同肠道微生物群组成的SPF级C57BL/6J小鼠具有不同水平的预先存在的S2交叉反应性抗体。许多研究注重细菌在健康和疾病中的作用,但对病毒的作用研究缺乏。Liu L等[34]借助C57BL/6J小鼠发现共生病毒通过RIG-I信号通路维持肠上皮内淋巴细胞稳态,从而维持肠道内稳态。

实验小鼠是多种人类疾病药物研发的重要临床前模型,但基因相同的小鼠疾病外显率和可重复性存在很大的差异,限制了许多常用模型的实用性[35]。Forster S C等[36]发现,Dunceniellamuricolitica和Alistipesokayasuensis在造成葡聚糖硫酸钠诱导的SPF级C57BL/6N小鼠炎症性肠病模型实验结果的差异中发挥主导作用,表明去除某些微生物将使SPF动物建立更为可靠的疾病模型。宏基因组测序使得我们可以借助SPF动物模型深入了解肠道微生物组与健康的相互作用,通过筛选差异菌群作为预测因子、作用靶标等使微生物更好地为人类健康服务。

5 小结

应用宏基因组测序借助SPF动物进行研究的报道越来越多,充分利用了SPF动物无特定病原体的优势,来探索微生物多样性、种群结构和功能以及微生物与环境、疾病的关系。随着测序技术和数据处理技术不断发展,宏基因组测序与转录组学、代谢组学等组学技术联用,将能够多角度、多层次的解析我们所面临的的科学问题。