新型抗生物膜药物研究进展

刘宝玲,陈天宝,柳旭辉,王 刚,王晓虎,蔡汝健*

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州 510640;2.仲恺农业工程学院动物科技学院,广东广州 510225;3.云浮力智农业有限公司,广东云浮 527500)

在自然界中,细菌多以生物膜的形式存在,细菌黏附、聚集于接触的生物或非生物表面,形成结构复杂的生物膜,以此保护细菌免受抗生素或其他不利因素的侵害并促进耐药菌株的产生,使细菌更难被根除。细菌生物膜是一种重要的毒力因子,在逃避宿主免疫系统、定植和感染中起着至关重要的作用,Bhattacharya M等[1]研究发现金黄色葡萄球菌生物膜能释放白细胞介素形成细胞外陷阱并逃避中性粒细胞介导的杀伤。生物膜的形成在临床上是个极大的困扰,因为细菌生物膜容易在医疗器械或植入物上附着,引起患者的反复感染或是影响金属植入物表面的电化学阻抗而导致植入物腐蚀[2]。美国国立卫生研究院(NIH)揭示,在所有微生物和慢性感染中,分别有65%和80%与生物膜形成有关[3]。

抗菌药物是抑制和去除细菌生物膜的有效药物,但由于生物膜对细菌的自我保护以及细菌对抗生素的耐药性,生物膜相关感染难以通过抗生素的治疗和免疫功能清除[4],大多数抗菌药物对细菌生物膜的抑制或消除效果不佳,并且容易加剧细菌的耐药。为了防止生物膜的形成或破坏病原菌的已形成的生物膜,抗菌药物潜在替代物新型抗生物膜药物的相关研究是当前的一个研究热点,其中主要包括纳米银、天然提取物、噬菌体、抗菌肽等,他们具有不同程度的抗生物膜效果,论文综述讨论了生物形成的相关影响因素以及抑制或消除细菌生物膜的新型药物的相关研究进展。

1 生物膜

1.1 生物膜形成的影响因素

微生物以不同或相同物种的联合体形式存在而形成生物膜,生物膜的形成是一个多步骤的复杂过程,包括细菌从自由的浮游状态向生物膜的固着形式的转变,细菌生物膜形成能力在一定程度上是菌株依赖性的,并受环境条件的影响。温度、pH、营养、黏附环境、群体感应对生物膜形成至关重要。

温度是决定细菌生物膜产量和密度的重要因素,并且影响细菌生物膜的结构和形状。Kim S等[5]研究表明温度对铜绿假单胞菌生物膜的形成影响显著,在20℃时生物膜总生物量和厚度显著增加,且不同菌株的情况均有不同。Bisht K等[6]发现温度不但影响铜绿假单胞菌生物膜的结构,并且影响其基因和蛋白的表达。

细菌生存离不开环境中的营养成分,营养成分和浓度以及特定盐类的存在会影响生物膜的形成,如钙、硫酸镁等[7]。短期的营养缺乏能增强细菌黏附,研究发现细菌在碱性环境和营养成分有效性降低的环境中形成生物膜能力增强[8],而长期的营养缺乏阻碍了生物膜的成熟。

黏附是细菌形成生物膜的重要一环,细菌所处的表面环境是细菌黏附的重要影响因素。研究表明,不同的环境中细菌的黏附能力不同,导致形成生物膜的能力也有所不同。细菌在粗糙的有机膜表面比光滑的玻璃盖玻片表面更容易形成生物膜[9]。

生物膜的形成涉及群体行为,并依赖于群体感应的复杂调节,群体感应相当于细菌的信号交流系统,细菌通过群体感应发出相应的信号,在细菌生物膜形成过程中调节各类信号分子的合成分泌,调节细菌的黏附、定植,生物膜的成熟、分散等[10]。

1.2 细菌生物膜的耐药机制

形成生物膜是大多数微生物的重要保护机制,并为微生物提供许多优势,如高传染性、抗菌药物抗性和强存活性。细菌抗菌药物耐药性和生物被膜形成能力之间呈正相关性[11],生物膜的顽固性是由复杂的物理和生物特性决定的,涉及多种遗传和分子因素以及微生物-宿主细胞的相互作用,生物膜促进细菌耐药的具体机制是复杂的。首先,生物膜的基质较厚,药物难以渗透,生物膜内部营养物质和氧气量少,细菌代谢频率低,对抗菌药物的消耗少[12];其次,生物膜存在排外机制,把药物排出的同时免受外界不利因素的干扰[13];耐药基因的积累也是生物膜促进耐药的重要原因,并有研究表明生物膜促进细菌耐药性的水平转移[14],自然形成的生物膜内的细菌类型往往是复杂的,单一抗菌药物难以对抗多种细菌。另外,群体感应除了影响生物膜的形成,也是诱导耐药性的重要原因。

2 抗生物膜药物

2.1 纳米银

纳米银(AgNPs)是近年来新型的抗菌材料,具有显著的抗菌作用,具有广谱、高效的特点,并且具有巨大的抗生物膜潜力。Hetta等[15]研究表明AgNPs抑制多重耐药的鲍曼不动杆菌生物膜的形成,Zhang Y等[16]研究发现AgNPs破坏铜绿假单胞菌生物膜,Ali A R等[17]研究发现AgNPs对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌具有抗生物膜活性。

AgNPs抗生物膜的机制主要包括抑制细菌的黏附和运动,刺激强烈的氧化应激反应,破坏铁稳态,阻断有氧和无氧呼吸,影响群体感应(QS)系统,抑制相关基因的表达[15,16,18]。虽然AgNPs具有广谱、高效、不易产生耐药的优点,但它的生物毒性是不容忽视的,并且AgNPs对细菌的作用不具有特异性,容易影响正常微生物的活性。

2.2 天然提取物

天然提取物是指采用一定的方法从天然产品中提取的相关化学成分,来源广且容易获得。大量的天然提取物具有抗生物膜的特殊功效,如中药提取物、植物精油。

2.2.1 中药及其提取物 中药及其提取物是重要的药物来源,近年来,中药抗生物膜的相关研究逐渐增多,并且研究表明许多中药及其提取物在抗生物膜上具有显著效果,例如,苦参、柴胡、大青叶、白头翁、板蓝根、蒲公英6味中药的水提液和醇提液在高浓度下对金黄色葡萄球菌生物膜均有不同程度的抑制作用[19];高浓度五倍子、红花及黄连水煎液能抑制维氏气单胞菌生物膜的形成[20],球姜酮能减少鲍曼不动杆菌生物膜的形成并能破坏其已形成的生物膜[21];大麻酚具有抗变形链球菌生物膜的作用,有可能成为龋齿预防治疗的潜在药物[22];大蒜对产生志贺毒素的耐药性大肠埃希氏菌表现出抗生物膜活性[23];中药及其提取物抑制细菌生物膜的可能机制是通过影响luxS/AI-2系统的控制[24],干扰群体感应系统、细菌的黏附及蛋白质表达[25]。

2.2.2 植物精油 植物精油(EOs)是从芳香植物中分离出的大量不同种类的萜类化合物和酚类化合物的混合物,在过去几十年中因其表现出广泛的生物特性而受到极大关注,研究表明大量精油是抗生物膜天然药物的极好候选物,近年来,在众多的精油种类中,关于抗生物膜研究报道比较多的精油包括:山苍子精油[26]、茶树精油[27]、丁香精油[28]、牛至精油[29]、百里香精油[30]、肉桂精油[31]等,根据这些研究数据,精油对细菌具有显著的抗生物膜的效果,其中包括了与人类疾病密切相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、耐药鲍曼不动杆菌等。精油大多以浓度依赖性方式强烈抑制生物膜形成,其主要作用机制包括:抑制相关基因的表达[26],影响生物膜内细菌结构的完整性和代谢活性[32],抑制胞外多糖和胞外蛋白的合成,抑制群体感应[33]等。

虽然精油具有显著的抗生物膜效果,并且来源广,制备简单,但由于其自身特性具有稳定性低、挥发性强、气味浓烈的缺陷,克服这些缺陷是精油进入临床应用之前所必须实现的。

2.3 噬菌体

噬菌体是存在于自然界中感染细菌的病毒,具有物种水平特异性的优势,如果用于治疗感染,将有利于保护正常微生物群体。研究发现噬菌体能有效抑制或消除细菌生物膜,能作为有价值的抗生物膜剂,Gong C等[34]研究发现噬菌体在室温下能有效地减少沙门氏菌在坚硬表面上附着和形成生物膜,Al-Zubidi M等[35]研究表明SHEF2噬菌体可以在体外根除粪肠球菌形成的生物膜。有研究报道了2种肠球菌噬菌体siphovirus vB-EfaS-Zip和podovirus vB-EfaP-Max能在不同温度和pH范围内稳定、高效地对抗多种生物被膜,短潜伏期并且对上皮细胞的没有细胞毒性,证明了它们在控制慢性伤口中存在的感染性生物被膜方面的治疗用途[36]。

如上所述,噬菌体有巨大的抗生物膜潜力,噬菌体的存在能降低生物膜的完整性和黏附性[37],在临床上有成功缓解难治性生物膜相关的假体膝关节感染的案例的报道[38]。噬菌体抗生物膜的优势包括它们在感染部位繁殖的能力、高特异性、防止副作用以及它们的进化能力,并且也不受抗生素耐药性的影响,但其特异性也是局限性,抗菌谱窄,单一噬菌体在多种微生物混合感染的治疗案例中不能覆盖到每种微生物[39],并且噬菌体本身作为病毒也可能会促发宿主免疫系统而被消灭。

2.4 抗菌肽

抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性,并且不容易引发耐药性,大量的研究表明抗菌肽具有显著的抗生物膜作用,使用抗菌肽作为抗生物膜剂有望成为控制生物膜相关感染的潜在方式。抗菌肽可以抑制细菌生物膜的形成或破坏已形成的生物膜,如抗菌肽Temprine-La(FS)抑制2型猪链球菌生物被膜形成[40]。Park S C等[41]研究发现合成抗菌肽可以减少铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌预先形成的生物膜;WLBU2和蜂毒素稀疏地分散生物膜而不破坏细菌[42]; 研究表明天然存在的人和牛乳铁素构建体的合成二聚肽具有进一步开发为抗生物膜剂的潜力[43]。Chen D等[44]研究发现形成淀粉样蛋白的六肽(AFhPs)对革兰氏阳性菌表现出高效的广谱抗菌膜活性,可作为潜在的新型抗生物膜剂。

如上所述,抗菌肽作为一种新型抗菌剂,在抗生物膜方面也具有巨大的潜力,主要通过抑制细菌的黏附[45]、影响相关基因的表达,阻断胞外多糖的合成与分泌[40]等方式来抑制生物膜的形成。通过去除碳水化合物、细胞外DNA和消除细胞外聚合物质[41]等方式破坏以形成的生物膜。

3 小结

生物膜在体内是异质的、复杂的,并且体内环境也较为复杂,因此药物在体内的作用要难于体外作用。目前抗生物膜药物的相关研究众多,在这篇综述中只列举了部分新型抗生物膜药物的相关文献,在这些文献中有许多体外试验证据支持纳米银、天然提取物、噬菌体、抗菌肽用于抑制或消除细菌生物膜的有效性,但很少有临床试验来评估其临床疗效,将各类抗生物膜药物进行系统性、比较性研究的文章也少有报道,这些药物也并没有真正成为抗生素的替代物,可能原因是它们的药理作用还没有研究透彻,其中可能存在未知的风险或是副作用,这也是未来的可研究方向。众所周知的是,生物膜是细菌的自我保护机制,如何去除这层保护,使药物能够直接作用于细菌以发挥抗菌作用是当下研究热点。另外,其具体作用机制的研究是使这些潜在抗生素替代物能真正走上临床的必经之路,在未来的研究中可以考虑进行系统性的研究,筛选出最优抗生物膜药物进行临床试验并评估疗效。