宏基因组二代测序在肺部感染合并呼吸衰竭中的应用*

张莹莹 刘 斌

安徽医科大学附属阜阳人民医院呼吸与危重症医学,安徽省阜阳市 236011

肺部感染是呼吸系统的常见临床疾病,是死亡的主要原因之一[1]。肺部感染合并呼吸衰竭使患者面临多病原体复合感染的风险,严重情况下发展为败血症或多器官衰竭,导致28d的死亡率很高,这对患者和医院来说是一个负担,不仅增加医疗费用,同时也增加患者住院时间[2-3]。因此控制肺部感染是治疗重要部分,但最初不合理治疗,使发病率和死亡率明显升高[4]。因此,根据病原体培养结果快速识别致病微生物并对抗菌药物进行调整,对急性和复杂感染非常重要。

检测呼吸道病原体的传统方法包括微生物学培养、形态学检查(涂片)、血清学检测等,然而,所有这些方法都有其缺点,如灵敏度低、耗时长等[5]。有研究发现,传统培养中高达60%未能检测出明确病原体[6]。随着技术发展,宏基因组二代测序(mNGS)应运而生,mNGS是一种检测样品中所有核酸的方法,包括对核酸片段进行扩增和精确测序,并与已知的参考片段进行比较、定位和整合,利用计算机算法获得目标核酸的完整序列,可以快速、高效和准确地直接检测临床样本中的基因组信息,全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫,在诊断效能方面优于传统检测[7]。目前对于mNGS在肺部感染合并呼吸衰竭方面相关研究缺乏,而在临床上病原学诊断对这类群体具有重要的意义。故本文旨在讨论mNGS对于肺部感染并发呼吸衰竭患者病原学诊断及临床治疗等价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2022年1月—2023年2月本院呼吸与危重症医学科收治肺部感染合并呼吸衰竭患者89例。这一研究符合本院伦理委员会的要求,患者在接受纤维支气管镜检查前均于检查同意书上签字。伦理批件号:医伦理审查[2022]14号。

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准:年龄≥18岁,男女不限;肺部感染、呼吸衰竭的诊断标准遵循《内科学》第9版[8]。(2)排除标准:①标本不合格者;②妊娠或哺乳期女性;③资料不全者。

1.3 资料收集 收集入选患者的传统培养及mNGS结果、抗生素使用情况、生化、C反应蛋白等血检。

1.4 传统病原体检测方法 本院行呼吸道病原体核酸检测(PCR-荧光探针法)、微生物的涂片、培养等,标本来源包括痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液等。

1.5 mNGS检测 mNGS 检验由天津金匙科技有限公司进行DNA 测序。首先将标本进行核酸提取,并对DNA质量进行评估,然后将构建的文库在Illumina测序仪器上检测,最后经过低质量序列过滤、人源序列去除等生物信息分析之后进行报告解读。mNGS 标本大部分来源于肺泡灌洗液,采样根据2017年《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识》[9],由于小部分患者无法进行支气管镜灌洗,进行痰液、胸腔积液、血液取样。

1.6 病原体判断 确定病原体[10],可包括以下任何一条:(1)传统检测确定的阳性病原体与mNGS确定的阳性病原体一致;(2)传统检测或mNGS确定的阳性病原体与患者的临床症状或治疗反应相同;(3)如果mNGS和传统检测检出不同,需与病原体致病的文献证据相一致。

1.7 分组标准 将肺部感染合并呼吸衰竭患者的宏基因检验数据与传统检验数据分为2组,分别为mNGS组与传统检测组。

1.8 统计学方法 统计分析采用 SPSS26.0 软件。正态分布的计量资料组间比较采用独立样本t检验或校正后的t检验,偏态分布的计量资料组间比较采用Mann-WhitneyU检验;计数资料以率(百分比)表示,组间比较采用χ2检验、McNemar检验或Fisher 精确检验。以P<0.05定义差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS和传统微生物检测结果比较 mNGS检测的阳性率为93.26%(83/89),高于传统微生物检测的69.66%(62/89),差异有显著统计学意义(P<0.01)。

2.2 mNGS和传统病原体培养检测(真菌+细菌培养)结果比较 在89例感染性患者中,均执行病原体培养检测及mNGS检测的共计81例,其中57例为传统病原学培养阳性(70.37%),行mNGS阳性77例(95.06%),两者的差异有显著统计学意义(P<0.01)。

2.3 mNGS和病原体核酸PCR检测结果比较 89例病例中有64例同时行病原体PCR检测及mNGS,其中PCR检测阳性31例(48.44%),mNGS阳性58例(90.63%),经检验两者差异有显著统计学意义(P<0.05)。

2.4 mNGS与传统方法效能比较 入组的89例患者,根据病原学检测及临床综合分析来分组,确定病原体组有80例,非确定病原体组有9例,见表1。mNGS与传统病原学检测灵敏度分别为98.75%(95%CI 92.27～99.93)、57.50%(95%CI 45.95～68.32),差异有统计学意义(P<0.05),特异度分别为55.56%(95%CI 22.65～84.66)、77.78%(95%CI 40.19～96.05),无统计学差异(P>0.05)。mNGS与传统病原学检测的阳性预测值(PPV)分别为95.18%(95%CI 87.45～98.44)、95.83%(95%CI 84.57～99.28),阴性预测值(NPV)83.33%(95%CI 36.48～99.12)、17.07%(95%CI 7.70～32.65)。

表1 mNGS与传统检测结果分布

2.5 发展为重症肺炎患者感染情况 纳入研究的89例患者中,有80例确定病原学,其中发展为重症肺炎的患者38例,未发展重症肺炎的患者42例。重症组患者病情更为严重,住院时长较久,具有较高的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞比率,较低的淋巴细胞计数、血小板,较高水平的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐,监护室住院时长较久,均较非重症组有显著性差异(P<0.05)。两组感染类型中可见,发展为重症肺炎患者单纯感染、混合感染、细菌病毒真菌混合感染较未发展为重症肺炎患者有统计学差异(P<0.05),感染类型分布见表2。

表2 重症组与非重症组感染类型分布[n(%)]

2.6 疾病转归情况 根据患者病原学检出情况、临床症状、辅助检查进行分析,判断病原微生物,并依此调整抗生素治疗。80例患者确定病原体,44例调整了抗生素应用,其中重症组24例,非重症组20例。两组的好转率差异有统计学意义(P<0.05),但病死率差异无统计学意义。见表3。

表3 两组患者疾病转归情况[n(%)]

3 讨论

肺部感染导致肺组织病变,肺部炎性渗出增多,引起通气功能障碍,此外,肺实质破坏导致气体弥散功能下降,最终引起呼吸衰竭,严重者各脏器功能损伤,甚至死亡。因此,对于肺部感染合并呼吸衰竭的患者,除给予呼吸支持外,尽早明确病原菌感染情况并采取针对性的抗感染治疗措施非常关键。事实证明,二代测序在诊断感染方面有很大的临床价值,并在一些指南和共识文件中被推荐[11-13]。本研究探讨mNGS 在肺部感染合并呼吸衰竭患者中的病原学诊断及对临床诊疗策略影响等方面的应用价值。此研究收集了在我院呼吸科住院并行mNGS检查的89例肺部感染合并呼吸衰竭患者,系统地比较了mNGS和传统病原学检测的检验结果。

本研究mNGS与传统检测方法进行了对比,结果显示mNGS检测的阳性率高于传统微生物检测,差异有统计学意义(P<0.01)。mNGS与传统病原体培养检测、病原体核酸PCR检测结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。综上,从传统微生物检测、传统病原体培养检测、病原体PCR检测比较,mNGS诊断优于以上检测项目。Wang J等[14]研究结果显示,mNGS在肺部混合感染中检出率高于传统方法,本研究结果与其一致。对于肺部感染合并低氧性呼吸衰竭需要早期精准抗感染治疗,因此mNGS检测非常重要,特别对于常规检测阳性率不高的病原体,如隐球菌、肺孢子菌等。对于一些复杂感染需要更大范围的病原筛查,而mNGS对此有一定指导作用。

Ying Li等[15]研究显示,在细菌诊断方面,mNGS对比培养法灵敏度及特异度分别为88.89%及74.07%,mNGS对比涂片法的灵敏度及特异度是100%及77.78%。Duan H等[16]研究发现,mNGS的灵敏度高于传统检测(67.4%VS 23.6%,P<0.05),而在特异度方面未见统计学差异(68.8%VS 81.3%,P>0.05)。本研究与上述研究结果相符合,mNGS灵敏度较传统病原学检测高,且具有统计学差异,而在特异度方面无统计学差异,这可能与入院前已使用抗生素等因素,一些病原体培养难度大有关[17]。在一些体液样本中,游离DNA很少,由于mNGS灵敏度较高,即使在微量核酸下mNGS也能获得大量数据,检出覆盖面广的微生物,为临床病原菌参考提供了有力证据。但是其特异度低,在报告中可能看到不致病病原体、不相关病原体,这些也与标本污染等原因有关,且不易鉴别,这需要质控对比后进行排除。因此,为明确诊断,还需联合传统检测技术,以协助对疾病致病菌的判断。

有研究表明在社区获得性肺炎患者中,混合性感染类型多见的是两种细菌感染或一种细菌感染与一种非典型病原体感染[18-19],重症肺炎中呼吸道病毒感染较常见,混合病毒—细菌感染增加死亡风险[20]。本研究数据发现,在发展重症肺炎与未发展重症肺炎患者相比,单纯感染、混合性感染有统计学差异(P=0.015、0.007),在混合性感染中感染类型为细菌、真菌、病毒的混合感染有统计学差异(P=0.028),表明混合感染较单一感染严重程度高,发展为重症肺炎可能性大,在10例细菌病毒真菌混合感染患者中,病死率为60%(6/10),提醒临床医生在重视此类感染的患者,在明确相关病原体后尽量早期合理应用抗生素,降低患者的死亡率。在一些基础疾病多,起病急,病情重,经验性抗感染治疗效果不佳,提示可能为少见病原学感染,应用mNGS检测快速筛查病原体,可早期靶向治疗干预,使患者得到积极有效治疗,阻止病情恶化。

本研究调整抗生素的患者有44例,重症组24例,非重症组20例。该两组的好转率差异有统计学意义(P<0.05),而病死率差异无统计学意义(P>0.05),考虑重症组部分患者病情恶化,家属要求自动出院,未予以纳入死亡例数的计算中有关。

mNGS应用广泛,但有一定局限,其本身测序读长的上限,影响一些遗传信息解析,且结果缺乏一致的判定标准。本研究也存在不足:(1)本文样本量较少,引起实验结果的偏差,结果需通过增加样本量进一步验证。(2)本研究中进行的mNGS检测均为DNA检测,未进行RNA检测,可能存在病原学结果与实际不符的情况。(3)样本送至外地实验室,这增加了样品污染和样品核酸降解风险。

mNGS给临床提供了大量病原体信息,在报告中有些病原学测序浓度低或序列数不高,难以作为金标准,也只是有提示意义。对于传统方法难以检测的微生物如厚壁结核菌、孢子菌等,mNGS阳性结果有较大意义。当然,临床医师不能单纯依靠检测手段来确定病原菌,应注重结合流行病学、不同类型患者等情况来进行综合评估,比如呼吸机相关性肺炎其常见病原菌类型与医院获得性肺炎相似,但病原谱分布有一定差别,且耐药率也不同,这些情况都需要医师考虑到。

综上,mNGS较传统培养检测病原菌阳性率更高,整体优于传统检测,根据mNGS检测病原体结果指导抗感染方案可以提高治疗效果,对指导临床具有重要价值。虽然mNGS价格昂贵,在临床应用中仍有一定的局限性,但在严重感染,疑难病例中,可将mNGS作为传统方法的补充,以促进精准医学的开展。