运动预适应对大鼠心肌S1P含量的影响及机制探讨

韦信暖 杨卫远 张丽琴 周俊香 江文星

（1 宁德师范学院附属宁德市医院康复医学科，福建 宁德 352100；2 宁德师范学院附属宁德市医院病理科，福建 宁德 352100）

运动预适应，是指反复短暂的间歇性大强度运动能够增强心脏对长时间缺血缺氧的耐受性，是减轻心肌缺血损伤的有效途径之一。一磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）于缺血预适应和缺血后适应中对心肌细胞具有保护作用[1-4]。但目前关于运动预适应心肌保护机制尚不明确。因此，本实验通过建立运动预适应和力竭运动动物模型，从而探讨和分析运动预适应对大鼠心肌S1P含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量200～220 g。常规分笼饲养，5只/笼。饲养条件：自由饮水饮食，室温20～22 ℃，相对湿度45%～50%，每日光照12 h。SD大鼠及其饲料由福建省吴氏实验动物中心提供，许可证：SCXK（沪）2018-0006。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[5]。

1.2 主要试剂 S1P、S1P1抑制剂W-146、MAPK阻滞剂PD98059以及P13K阻滞剂LY-294002均为美国GlpBio公司产品。原位末端转移酶标记（TUNEL）、AnnexinV-FITC／PI试剂盒均为德国Roche公司产品。

1.3 分组和长期运动预适应大鼠模型的建立 将大鼠适应性饲养1周，每日进行15 min无负重游泳运动。1周后将50只大鼠随机分为正常对照组（C组5只）、运动预适应组（EP组5只）、运动预适应+S1P受体阻滞剂W146组（EP+W146组6只），运动预适应+P13K阻滞剂LY-294002组（EP+LY294002组6只）。C组常规饲养3周，其余各组大鼠以尾部负重的方式进行间歇性游泳运动，负重为3%体质量，参照Margonato等[6]的方法建立长期运动预适应动物模型：每日进行15 min无负重游泳运动，1周后以尾部负重的方式进行间歇性游泳运动，泳池深40 cm，直径50 cm，水温（37±2）℃，尾部负重为3%体质量，运动持续3周，每周6 d，逐渐增加运动时间，第1周运动30 min/d，第3周2 h/d。EP+W146组在每日运动预适应前10 min，腹腔注射S1P受体阻滞剂W146（20 mg/kg）；EP+LY294002组在每日运动预适应前10 min，腹腔注射P13K阻滞剂LY294002（10 mg/kg）。余处理同EP组。3周后，C组、EP组、EP+W146组、EP+LY294002组大鼠进行一次性力竭游泳运动，负重为3%体质量，3组大鼠力竭判断标准为大鼠游泳动作明显失调，划水频率极其缓慢，连续下沉，不能再坚持。

1.4 指标测定方法 建模结束后30 min，将各组大鼠以体积分数0.4%戊巴比妥钠（10 µl/g）腹腔麻醉后，呈仰卧位固定，迅速开胸取心脏，吸干血液，进行称重，经预冷的灭菌生理盐水清洗后，研磨成浆后一部分用S1P ELISA试剂盒检测大鼠心肌组织S1P的含量，采用TUNEL法检测心肌细胞调亡改变。

采用酶联免疫法按试剂盒说明书检测大鼠心肌S1P的含量，试剂盒购于武汉云克隆公司，测定仪器为美国博腾公司的BioTek检测仪。心肌细胞凋亡的测定：心肌细胞凋亡测定采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL），实验步骤按照试剂盒说明书流程进行。光学显微镜下可见凋亡心肌细胞的胞核呈荧光绿，正常心肌细胞的胞核呈蓝色。每组随机取切片5张，每张切片随机取视野5个（×400），在光学显微镜下观察并计算心肌细胞的凋亡指数。心肌凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 统计学处理 运用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，正态数据以表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同干预后各组大鼠心脏重量比较 与C组相比，EP+LY294002组大鼠心脏重量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；EP组也较C组减轻，但差异无统计学意义。与EP组相比，EP+W146组，大鼠心脏重量增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）。EP+W146组大鼠心脏重量高于EP组、EP+LY294002组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同干预后大鼠心脏重量、心肌S1P含量及心肌细胞凋亡比较

2.2 不同干预后大鼠心肌S1P含量比较 与C组相比，EP组S1P含量升高，且差异有统计学意义（P＜0.05）；EP组、EP+PD98059组、EP+LY294002组心肌S1P含量均高于C组，但差异无统计学意义。见表1。

2.3 不同干预后大鼠心肌细胞凋亡染色结果 心肌细胞凋亡染色：C组可见广泛分布的大量凋亡心肌细胞；EP组可见凋亡心肌细胞散在分布；EP+W146组可见少量的凋亡心肌细胞；EP+LY294002组可见较多的凋亡心肌细胞。见图1。心肌凋亡指数图像分析显示：与C组相比，EP组、EP+W146组、EP+LY294002组心肌凋亡指数下降（P＜0.05）；与EP组相比，EP+W146组、EP+LY294002组心肌凋亡指数上升（P＜0.05）；与EP+W146组相比，EP组心肌凋亡指数下降（P＜0.05）。见表1。

图1 不同干预后大鼠心肌细胞凋亡染色结果

3 讨论

心血管系统疾病患病率逐年上升，严重影响人们的生活质量，对于有效的预防心血管疾病的发生、发展显得极为重要，心脏康复任重道远，而运动处方作为心血管康复的五大处方之一，具有极为关键的作用。运动处方中最主要的就是有氧运动，有关动物实验的研究表明，有氧运动可增加骨骼肌细胞S1P释放，细胞外的S1P可通过激活骨骼肌的卫星细胞刺激成肌细胞的分化，且SIP具有促进骨骼肌细胞修复的功能及维持骨骼肌细胞应对运动等刺激时的正常生理功能[7]。

本实验结果显示，EP+W146组与EP组相比力竭运动大鼠心肌S1P含量明显减少、心脏重量明显增加，且EP组力竭运动大鼠心肌细胞凋亡较EP+W146组力竭运动大鼠明显减少，均提示S1P对力竭运动大鼠的心肌起保护作用。其机制可能是通过促进骨骼肌的S1PR的表达发挥肌肉的生物学作用，如兴奋-收缩偶联、增强线粒体的功能从而促进骨骼肌细胞的对运动训练的适应能力从而发挥保护作用[8]。体外大鼠的实验也表明，外源性S1P可促进体外培养的大鼠骨骼肌成肌细胞增殖，而其作用可能与细胞内SphK活性增加引起细胞内S1P生成增多相关[9]。而运动导致S1P含量升高的机制可能是，通过运动增加血浆中S1P含量增加，进而导致骨骼肌中S1P含量增加，以及由于运动促进了血管内皮细胞S1P的释放[8,10-11]。

既往文献报道，S1P可影响JAK2/STAT3信号通路[12]、PI3K/Akt信号通路[13]等从而发挥心肌保护作用。亦有研究报道，可通过诱导心肌Nrf2/Keap1通路增加抗氧化酶含量，来改善力竭所致心功能降低及缺血损伤，从而发挥保护心肌的作用[14]。亦有研究表明，S1P可能是通过调节PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的表达，来有效抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡[15]。本研究结果提示，EP+PI3K抑制剂LY294002ZU组力竭运动大鼠S1P含量少于EP组，且细胞凋亡也明显高于EP组，提示PI3K/Akt通路参与了运动预适应对力竭大鼠心肌的保护作用。但运动预适应是否可能通过上述信号通路从而影响S1P的合成，有待进一步实验验证。

综上所述，运动预适应可提高力竭运动大鼠心肌S1P含量，其机制可能通过P13K/Akt信号通路发挥心肌保护作用。