GeneXpert MTB/RIF和TB-DNA两种荧光PCR方法检测肺外结核脓液样本的效能分析

邵燕琴 朱明智 戴玲珊 彭利君 梅宾 方婷婷 蔡龙

肺外结核的临床表现不典型,培养是肺外结核诊断的金标准,然而BACTEC MGIT 960液体培养(简称“ MGIT 960培养”)至少需要2～3周才能获得结果,且敏感度相对较低。分子检测技术在肺外结核的早期诊断中得到广泛应用,具有准确、高效等优点,为肺外结核的诊断和治疗带来了新的曙光[1]。

GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)和结核/非结核分枝杆菌PCR荧光探针法(简称“TB-DNA”)检测均是通过实时荧光PCR检测结核分枝杆菌(MTB)的常用分子诊断手段,广泛应用于痰液标本的检测并在肺结核的诊断中取得了良好的效果。TB-DNA可以同时报告MTB和非结核分枝杆菌(NTM)的感染情况。虽然Xpert和TB-DNA检测技术已在临床中广泛开展[2-4],但在脓液样本中两种方法的诊断价值尚未得到全面评估。本研究旨在应用Xpert和TB-DNA检测疑似肺外结核患者脓液样本,并与MGIT 960培养结果进行对比,评估两种荧光PCR方法检测脓液样本对肺外结核的诊断效能。

对象和方法

一、研究对象

采用回顾性研究方法,收集2021年1月至2023年2月期间杭州市红十字会医院收治的疑似肺外结核并在病灶部位获取脓液样本的患者530例。排除142例(重复42例、检测结果不全95例和复治患者5例),最终共纳入388例患者。本研究经杭州市红十字会医院伦理委员会批准(批号:2022-118),所有研究对象均知情同意。

二、纳入和排除标准

1.纳入标准:(1)初治结核病患者(尚未开始结核病治疗的患者,或正在进行标准化疗方案用药而未满疗程的患者,或不规则化疗未满1个月的患者)[5];(2)同时进行Xpert、TB-DNA和MGIT 960培养检测。

2.排除标准:(1)重复病例;(2)诊断不明的病例。

三、研究方法

1.仪器及试剂:GeneXpert MTB/RIF实时荧光PCR检测仪及配套试剂(美国赛沛公司);结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(成都博奥晶芯生物有限公司);BACTEC MGIT 960液体培养系统及试剂(美国BD公司)。

2.标本采集和处理:在超声引导下确定最佳穿刺部位,利用注射器及细针头对病灶部位进行抽吸获得脓液标本,或者手术获得脓液标本,同时进行Xpert、TB-DNA和MGIT 960培养。

3.Xpert:采用美国赛沛公司生产的Xpert检测系统及相应试剂盒进行自动化检测。按试剂说明书操作,在1～2 ml脓液中加入2倍体积的处理液,涡旋振荡15～30 s并室温放置10 min,然后再次将混合物涡旋振荡10 s,室温下孵育5 min,最后将2 ml处理后的样本加入Xpert 反应盒中。2 h后系统可自动判读MTB检测结果与利福平耐药情况,MTB报告“检出”和“未检出”,MTB检出的病例根据循环阈值(Ct值)将细菌载量分为“高”“中”“低”或“极低”,利福平耐药报告为“检出”“未检出”和“不确定”。

4.TB-DNA:采用成都博奥晶芯生物有限公司生产的分枝杆菌核酸检测试剂盒,按试剂说明书进行操作,将脓液样本进行4%NaOH溶液均质化处理,转移至含有玻璃珠的离心管中,离心收集沉淀,缓冲液洗涤1次,最后加入试剂盒中的DNA提取液,在涡旋振荡器上以最大速率振荡5 min,95 ℃水浴5 min,12 000×g离心1 min,取上清待用,用实时荧光定量PCR仪检测MTB特异性多拷贝重复插入序列IS6110和分枝杆菌属共有基因—hsp65基因,扩增曲线呈S型且Ct值<40判定为阳性,扩增曲线不呈S型或Ct值≥40(或无任何数值)则为阴性。hsp65阳性IS6110基因阳性为MTB阳性,hsp65阳性IS6110基因阴性为NTM阳性。

5.MGIT 960培养: 严格按照仪器操作说明进行分枝杆菌培养,液体培养使用BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养仪,培养42 d内仪器检测信号达到阳性的培养物进行抗酸染色确认,抗酸染色阳性则通过TB-DNA鉴别MTB和NTM。鉴别为MTB记为培养阳性,仪器报阴或鉴别为NTM或抗酸染色阴性均为阴性。

四、统计学处理

利用MedCalc Statistical软件进行数据统计分析,计数资料采用“构成比或百分率(%)”描述。分别以临床诊断和MGIT 960培养为参考标准,分析3种检测技术检测肺外结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、ROC曲线下面积 (area under the curve,AUC),一致性分析采用Kappa检验,Kappa值在0～0.20为极低一致性、0.21～0.40为一般一致性、0.41～0.60为中等一致性、0.61～0.80为高度一致性、0.81～1.00为几乎完全一致。

结 果

一、阳性检出情况

纳入的388例患者中,男性216例,女性172例,中位年龄为52岁;结核病组328例,非结核病组60例。其中,结核病组均为肺外结核患者,其脓液样本分别来源于骨关节59例(15.21%)、淋巴结129例(33.25%)、腔体(腹腔、盆腔、胸腔)113例(29.12%)、其他部位(附睾、臀部、背部)27例(7.00%)。非结核病组分别来源于化脓性脊柱炎35例、胸壁脓肿15例、腰椎脓肿10例。

二、以临床诊断为标准分析3种方法对结核病的诊断效能

以临床诊断为标准,Xpert、TB-DNA和MGIT960培养的敏感度分别为84.15%、84.45%、30.18%;阴性预测值分别为53.57%、54.05%、20.76%;3种方法检测的特异度和阳性预测值均为100.00%(表1)。一致性分析显示,TB-DNA和Xpert与临床诊断高度一致(Kappa值分别为0.62和0.63),MGIT 960培养与临床诊断为极低一致性(Kappa值为0.12)。TB-DNA和Xpert检测的AUC值均为0.92,高于MGIT 960培养的AUC(0.65)。见图1。

表1 以临床诊断为参考标准分析3种方法对结核病的诊断效能

注 Xpert:GeneXpert MTB/RIF;TB-DNA:结核/非结核分枝杆菌PCR荧光探针;培养:BACTEC MGIT 960液体培养图1 以临床诊断为参考标准,3种检测方法检测结核病的ROC曲线

三、 以MGIT 960培养为参考标准,各检测方法对结核病的诊断效能

以MGIT 960培养为参考标准,Xpert和TB-DNA检测结核病的敏感度分别为89.90%和92.93%;阴性预测值分别为91.07%和93.69%;阳性预测值分别为32.25%和33.21%;特异度分别为35.29%和35.99%,具体见表2。TB-DNA检测的AUC值为0.65,Xpert检测的AUC值为0.63,具体见图2。

表2 以MGIT 960液体培养为标准分析Xpert和TB-DNA对结核病的诊断效能

注 Xpert:GeneXpert MTB/RIF;TB-DNA:结核/非结核分枝杆菌PCR荧光探针法图2 以MGIT 960培养为参考标准绘制的2种分子检测方法检测结核病的ROC曲线

四、Xpert和TB-DNA的一致性分析

在388例患者样本中,TB-DNA和Xpert同时检测出MTB阳性262例,两种方法均未检出97例,TB-DNA阳性Xpert阴性15例,TB-DNA阴性Xpert阳性14例。29例不一致的患者数据见表3。

表3 Xpert和TB-DNA检测结果不一致的患者信息

五、Xpert检测对利福平耐药性的检测结果

328例肺外结核患者中,Xpert检测MTB阳性276例、利福平耐药12例,利福平耐药率为4.35%(12/276)。

讨 论

以临床诊断为标准时,国外文献报道Xpert检测脓液样本的敏感度为83%～94.6%[2, 6],国内文献显示TB-DNA检测脓液样本的敏感度为58.90%～88.23%[7-8]。本研究以临床诊断为参考标准时,Xpert检测的敏感度为 84.15%,TB-DNA检测的敏感度为84.45%,一致性分析显示,TB-DNA和Xpert与临床诊断高度一致(Kappa值分别为0.62和0.63)。然而,一些研究结果显示,在痰液或其他非呼吸道标本中,Xpert检测的敏感度明显高于TB-DNA[4, 7, 9]。这可能是由于脓液和痰液的成分有所不同,肺外脓液样本直接从疾病部位取样,成分相对单一,主要包含细菌和坏死白细胞,蛋白含量较高;而痰液中含有黏液、异物、病原微生物、炎症细胞和脱落的黏膜上皮细胞等多种成分,干扰PCR反应的物质较多。Xpert提取核酸的过程中进行了纯化,但TB-DNA没有纯化这一步,纯化能够减少影响PCR反应的干扰物质,因此,痰液样本对TB-DNA的影响可能较大。另外,脓液中变性蛋白含量高,菌体外可能包裹有蛋白质,细菌破壁较难。TB-DNA 破壁是通过在液化离心后的沉淀物中加玻璃珠裂解,加入玻璃珠会使破壁更充分[10],而Xpert是无玻璃珠的情况下通过超声进行裂解。是否是以上两个因素还需要进一步确认。

以MGIT 960液体培养为参考标准时,Xpert和TB-DNA也具有同等的检测效能,但与临床诊断相比, Xpert和TB-DNA的特异度(35.29%和35.99%)、阳性预测值(32.25%和33.21%)都有所降低。虽然MGIT 960培养是结核病诊断的金标准,但由于培养的敏感度低于分子检测技术,许多临床确诊患者培养阴性而分子检测阳性。因此,当以培养为参考标准时,两种分子检测方法均会出现假阳性,导致其特异度较低。由于本研究为回顾性分析,Xpert或TB-DNA检测出阳性的患者均诊断为结核病,因此,以临床诊断为参考标准时,Xpert或TB-DNA特异度均为100.00%。

在本研究388例患者样本中,TB-DNA和Xpert检测结果不一致的有29例,其中TB-DNA单独检出15例,Xpert单独检出14例。Xpert未检出TB-DNA检出阳性的15例患者样本的取材部位有6例来自骨关节、4例来自淋巴结、5例来自腔体,且大部分样本的检测Ct值在33以上,说明样本中细菌的载量较低。另一方面, Xpert检出但TB-DNA阴性的14例样本中,1例来自背部、3例来自淋巴结、10例来自腔体,Xpert检测结果的细菌载量以低和极低为主。TB-DNA检测的是多拷贝的IS6110基因,而Xpert检测的是单拷贝的rpoB基因,理论上TB-DNA最低检出限要低于Xpert,但14例Xpert检出的样本而TB-DNA未检出。这14例样本中,大部分来自于腔体,可能原因是腔体中成分复杂(如血红蛋白等干扰物质);TB-DNA无对样本DNA提纯的步骤,干扰物质影响了PCR反应导致假阴性;另外,也有可能是脓液样本细菌分布不均匀造成实验取材差异引起。值得注意的是,所有来自骨关节脓液的样本中,未发现Xpert检出阳性而TB-DNA未检出的样本,可能是由于骨关节病变部位的少杆菌性质引起[11],表明在骨关节脓液样本中,TB-DNA的检出率可能优于Xpert,但需要进一步的分析和研究。

目前,Xpert检测成本较高[12],而TB-DNA为国产试剂,成本较低。考虑到成本效益,对初治肺外脓液样本可优先选择TB-DNA进行初筛。本研究结果显示,初治患者脓液样本Xpert的利福平耐药检出率为4.35%,由于TB-DNA不能检测利福平耐药,因此,TB-DNA初筛阳性样本如需获得利福平耐药信息可以使用Xpert、靶向测序和熔解曲线等方法进行检测。

本研究局限性在于非结核组患者例数相对较少,由于杭州市红十字会医院为浙江省结核病诊疗中心,肺外结核患者较多,无偏差的连续纳入所有符合条件的病例,可导致两组样本数量的比值相对较大。

综上所述, 对于初治肺外结核患者,患者获得脓液样本后可以先使用TB-DNA进行初筛,初筛阳性样本再通过其他检测方法获得耐药信息。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献邵燕琴:文章撰写和修改;朱明智、戴玲珊、梅宾和方婷婷:文献查找;彭利君和蔡龙:文章修改和审阅