新型化合物舒达吡啶(WX-081)对脓肿分枝杆菌的抗菌活性

苏雷 刘丽娜 王庆枫 初乃惠 聂文娟

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)引起肺部感染的发病率和死亡率在全球范围内不断升高[1]。NTM包括快生长分枝杆菌和慢生长分枝杆菌。脓肿分枝杆菌是最常见的快生长分枝杆菌。因为脓肿分枝杆菌对大部分抗生素天然耐药,所以美国胸科协会和传染病学会推荐的抗脓肿分枝杆菌病药物非常有限[2-3]。

贝达喹啉是一种二芳基喹啉类抗结核药物,可抑制三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成酶活性,从而阻止ATP产生[4]。世界卫生组织提倡使用贝达喹啉作为耐药结核病治疗药物[5]。既往研究发现,贝达喹啉对NTM亦有效[6-8]。但贝达喹啉引发的心脏QT间期延长限制了其临床应用[9]。舒达吡啶(WX-081)是一种新的二芳基吡啶类似物[10],具有与贝达喹啉相似的抗分枝杆菌活性,对心脏影响更小[11],作为一种抗结核药物正在中国进行Ⅲ期临床试验,但其作为抗NTM,尤其是抗脓肿分枝杆菌药物活性未知。本研究使用脓肿分枝杆菌标准株和临床株进行体外实验和构建脓肿分枝杆菌感染斑马鱼的动物模型,以评估WX-081对脓肿分枝杆菌体外和体内生长,以及对宿主存活的影响。

材料和方法

一、实验材料

脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977和7株脓肿分枝杆菌临床分离株均来自首都医科大学附属北京胸科医院。细菌接种于改良罗氏斜面培养基上,37 ℃ 进行活化,挑取干燥单菌落于Middle Brook 7H9肉汤液体培养基中,37 ℃,140 r/min摇床培养,传代后使用。野生AB型斑马鱼动物模型来自杭州环特实验室(实验动物使用许可证号SYXK浙2022-0004,饲养管理符合国际AAALAC认证编号:001458)。本研究获得首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准(编号:2021-020)。

二、试剂和仪器

1.试剂:WX-081由上海嘉坦医药科技有限公司馈赠,阿奇霉素和贝达喹啉购自美国Sigma公司。DIO绿色荧光染料购自美国赛默飞世尔科技有限公司;二甲基亚砜和甲基纤维素均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;PBS缓冲液购自北京兰杰柯科技有限公司;改良罗氏培养基购自青岛海博生物技术有限公司;Middle Brook 7H9肉汤培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

2.仪器:解剖显微镜SZX7(日本Olympus公司)、CCD相机VertA1(上海土森视觉科技有限公司)、电动聚焦连续变倍荧光显微镜AZ100(日本尼康株式会社)、显微注射仪IM-300(日本Narishige公司)、拉针仪PC-10(日本Narishige公司)、精密电子天平CP214(美国Ohaus公司)、台式大容量低速离心机TD5A(长沙英泰仪器有限公司)、电子比浊仪DensiCHEKTM Plus(法国生物梅里埃公司)、六孔板(上海耐思科学有限责任公司)。

三、研究方法

1.最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)测定:美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐分枝杆菌药物敏感性试验(简称“药敏试验”)采用肉汤微量稀释法,药物根据CLSI要求制备,向96孔板中的脓肿分枝杆菌中分别添加阿奇霉素、贝达喹啉和WX-081。脓肿分枝杆菌在37 ℃固体罗氏培养基上4～6 d达生长对数期,与实验药粉培养3 d,后每孔加入70 μl 阿尔玛蓝溶液,再孵育24 h后读取MIC。根据CLSI推荐的敏感和耐药折点判断药敏试验结果。

2.脓肿分枝杆菌感染斑马鱼模型的构建:野生AB型斑马鱼自然配对交配和繁殖,28 ℃未氯化淡水饲养。光滑型脓肿分枝杆菌ATCC19977在10% OADC增菌液和0.05%吐温80 Middle Brook 7H9肉汤培养基孵育达生长对数期,重悬于0.05%吐温80 PBS缓冲液,均化和超声后静置,细菌沉降管底5～10 min后去除多余液体,收集沉淀细菌重悬于PBS缓冲液,DIO绿色荧光染料标记细胞悬浮液。斑马鱼受精后2 d,注射斑马鱼尾静脉3.6×103菌落形成单位,建立脓肿分枝杆菌感染斑马鱼模型。

3.斑马鱼对抗菌药最大耐受浓度(maximum talerated concentration,MTC)测定:斑马鱼受精后3 d分配至6孔板,每孔30只。实验药品按照以下浓度进行2倍稀释至6孔板:(1)阿奇霉素:62.50 μg/ml、125.00 μg/ml、250.00 μg/ml、500.00 μg/ml和1000.00 μg/ml;(2)贝达喹啉:3.91 μg/ml、7.81 μg/ml、15.60 μg/ml、31.20 μg/ml和62.50 μg/ml;(3)WX-081:15.70 μg/ml、31.30 μg/ml、62.50 μg/ml、125.00 μg/ml、250.00 μg/ml、500.00 μg/ml和1000.00 μg/ml。设置无菌感染对照组和无药品感染斑马鱼模型组。于35 ℃下观察对照组、模型组和实验组中斑马鱼MTC。鱼体形态正常且活动自如则认为鱼的生存情况健康,鱼体弯曲则认为鱼的生存情况受到影响。

4.抗菌药对斑马鱼体内脓肿分枝杆菌抑菌检测:斑马鱼受精后3 d分配至6孔板,每孔30只。阿奇霉素MTC浓度为62.50 μg/ml,贝达喹啉MTC浓度为15.60 μg/ml,WX-081浓度依次为1.95 μg/ml、3.91 μg/ml、7.81 μg/ml、15.60 μg/ml、31.20 μg/ml和62.50 μg/ml。35 ℃孵育48 h,每孔30只斑马鱼中随机选择10只进行荧光显微镜拍照,应用图像处理软件(NIS Elements D 3.20)收集分析图像数据,分析斑马鱼不同部位荧光强度(即反映菌量强度)。

5.抗菌药对斑马鱼存活效果的评估:显微镜下观察斑马鱼后,转移到50 ml烧杯中。将阿奇霉素、贝达喹啉和WX-081稀释在20 ml烧杯中,阿奇霉素浓度为62.50 μg/ml,贝达喹啉浓度为15.60 μg/ml,WX-081浓度分别为1.95 μg/ml、3.91 μg/ml和7.81 μg/ml,每组斑马鱼总数60只,在35 ℃下孵育,记录终点为从受精后第4天至第9天每天斑马鱼死亡数量,并将死去的斑马鱼移走。实验结束后对数据进行统计分析,比较不同组斑马鱼的死亡情况。

四、统计学处理

结 果

一、WX-081对脓肿分枝杆菌的MIC测定

WX-081对1株脓肿分枝杆菌标准株和7株临床分离株的MIC范围为0.7813～1.5625 μg/ml(表1)。WX-081对脓肿分枝杆菌标准株和大部分临床分离株的MIC均低于1 μg/ml。

表1 舒达吡啶(WX-081)对脓肿分枝杆菌的MIC值水平

二、斑马鱼对不同药品的MTC

阿奇霉素浓度≤62.50 μg/ml时斑马鱼生存状态无变化,在125.00 μg/ml和500.00 μg/ml时出现心脏瘀血2只,在1000.00 μg/ml时死亡率为33.3%(10/30)。贝达喹啉浓度≤15.60 μg/ml时斑马鱼生存状态无变化,在31.20 μg/ml时4只肾水肿、2只心包水肿、1只心脏血瘀,在62.50 μg/ml时死亡率为96.7%(29/30)。WX-081浓度≤62.50 μg/ml 时斑马鱼生存状态无变化,在125.00 μg/ml 时2只心脏淤血、3只身体弯曲(提示生存状况受损),在250.00 μg/ml时死亡率为10.0%(3/30),在500.00 μg/ml时死亡率为100.0%(30/30)。故斑马鱼对阿奇霉素、贝达喹啉和WX-081的MTC分别为62.50 μg/ml、15.60 μg/ml和62.50 μg/ml。

三、不同抗菌药物对脓肿分枝杆菌活性的影响

作为阳性对照组的阿奇霉素62.50 μg/ml组的斑马鱼全身荧光强度为433 684±11 910,明显低于未用药感染动物模型组(671 089±22 305),差异有统计学意义(t=9.389,P<0.001);作为阳性对照组的贝达喹啉15.60 μg/ml组的斑马鱼全身荧光强度为438 648±8280,明显低于未用药感染动物模型组,差异有统计学意义(t=9.770,P<0.001)。全身荧光强度建模成立。

WX-081浓度为11.95 μg/ml、3.91 μg/ml、7.81 μg/ml、15.60 μg/ml、31.20 μg/ml、62.50 μg/ml时斑马鱼全身荧光强度分别为535 952±23 902、520 519±18 208、492 988±17 182、462 296±14 360、 419 947±13 302、375 347±11 359,随WX-081 浓度升高逐渐下降,且均分别明显低于未用药的感染动物模型组,差异均有统计学意义(t值分别为4.134、5.229、6.326、7.871、9.670、11.815,P值均<0.001)。

作为阳性对照组的阿奇霉素62.50 μg/ml组的斑马鱼头部荧光强度为433 684±11 910,明显低于未用药感染动物模型组(671 089±22 305),差异有统计学意义(t=4.871,P<0.001);作为阳性对照组的贝达喹啉15.60 μg/ml组的斑马鱼头部荧光强度为438 648±8280,明显低于未用药感染动物模型组,差异有统计学意义(t=4.565,P<0.001)。头部荧光强度建模成立。

WX-081浓度为11.95 μg/ml、3.91 μg/ml、7.81 μg/ml、15.60 μg/ml、31.20 μg/ml、62.50 μg/ml时斑马鱼头部荧光强度分别为101 579±6065、101 495±10 160、93 190±5468、89 877±10 333、76 778±4906、70 976±5726,随WX-081浓度升高逐渐下降,且均分别明显低于未用药的感染动物模型组,差异均有统计学意义(t值分别为2.639、2.170、3.444、2.872、4.999、5.336,P值均<0.001)。

四、抗菌药对斑马鱼存活效果的评估

从斑马鱼受精后第4天观察至受精后第9天,未用药感染动物模型组死亡率为66.7%(40/60),阿奇霉素62.50 μg/ml组死亡率为88.3%(50/60),贝达喹啉15.60 μg/ml组死亡率为48.3%(29/60)。WX-081浓度为1.95 μg/ml、3.91 μg/ml和7.81 μg/ml时,斑马鱼死亡率分别为90.0%(54/60)、85.0%(51/60)和81.7%(49/60),即随着WX-081浓度逐渐升高,脓肿分枝杆菌感染斑马鱼的死亡率逐渐下降(P<0.05)。

讨 论

作为治疗耐药结核病的一线药物,贝达喹啉的心脏毒性限制了其应用。WX-081是一种贝达喹啉类似物,其抗菌活性与贝达喹啉相似,不良反应可能更少。WX-081在小鼠和大鼠的组织中药物浓度水平均超过贝达喹啉,肺部尤其明显。既往研究显示,WX-081可能对脓肿分枝杆菌有效,但只评估了少量菌株的体外抗脓肿分枝杆菌活性[12],需要进一步进行动物模型的体内验证。

斑马鱼是一种小型淡水鱼,由于其先天和后天免疫系统与哺乳动物相似,且具有实时可视化功能,故常被用作人类疾病的动物模型[13]。近年来,越来越多的研究人员使用斑马鱼做脓肿分枝杆菌感染动物模型,评价药物体内抗菌活性[14-17]。

既往研究显示,WX-081对脓肿分枝杆菌标准株MIC为0.25 μg/ml,提示其可能具有抗体外脓肿分枝杆菌活性[12]。本研究对WX-081抗脓肿分枝杆菌临床分离株活性再次进行验证,体外药敏试验MIC范围为0.7813～1.5625 μg/ml,均低于1 μg/ml,再次证明WX-081具有良好的体外抗脓肿分枝杆菌活性。此外,本研究首次使用脓肿分枝杆菌感染斑马鱼模型进行WX-081抗脓肿分枝杆菌体内活性研究,结果显示,随WX-081浓度升高感染荧光标记后的脓肿分枝杆菌的斑马鱼全身荧光强度逐渐降低,提示鱼体内的脓肿分枝杆菌菌量随WX-081 浓度升高逐渐下降,验证WX-081可能具有良好的体内抗脓肿分枝杆菌活性。

既往研究表明,贝达喹啉可能会自由进入血脑屏障功能完整的肺结核患者脑脊液[18]。斑马鱼体内存在血脑屏障,故该特征可用于研究药物是否透过血脑屏障[19]。本研究分析WX-081不同浓度下感染荧光标记后的脓肿分枝杆菌的斑马鱼头部荧光强度变化,结果发现随着WX-081浓度的逐渐增加,斑马鱼头部的荧光强度逐渐降低,即菌载量逐渐下降。该结果表明,WX-081可能会透过血脑屏障,发挥其抗脓肿分枝杆菌效果。未来还有待更多动物模型研究再次验证。

据文献报道,应用不同浓度的脓肿分枝杆菌注射斑马鱼成鱼会对斑马鱼的存活率造成不同的影响[14]。本研究应用3.6×103菌落形成单位脓肿分枝杆菌剂量下注射斑马鱼,在斑马鱼受精后第4天至第9天,随着WX-081浓度升高(1.95 μg/ml、3.91 μg/ml和7.81 μg/ml),斑马鱼死亡率逐渐下降。从而,再次验证WX-081对脓肿分枝杆菌的抗菌活性。

本研究具有一定的局限性。首先,本研究没有分析WX-081对其他脓肿分枝杆菌亚种的抗菌活性,如massiliense亚种和bolletii亚种。第二,本研究中脓肿分枝杆菌临床分离株数量有限,未来应扩大样本量进一步验证研究结果。

综上所述,WX-081可有效抑制脓肿分枝杆菌在体外和斑马鱼感染模型体内的生长,且随着浓度增加可延长感染脓肿分枝杆菌斑马鱼的存活时间,显示出其对脓肿分枝杆菌较好的抗菌活性。

志谢感谢首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所样本库支持;感谢上海嘉坦医药科技有限公司李永国和李磊老师提供WX-081试剂;感谢南京环特实验室徐懿乔和曹慧卓老师提供斑马鱼感染动物模型技术支持

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献苏雷和刘丽娜:酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析、获取研究经费;王庆枫:实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章;初乃惠和聂文娟:酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、行政/技术/材料支持、指导、支持性贡献