结核抗原检测试剂国家参考品的研制

石大伟 陈湘霖 董文竹 文舒安 张婷婷 王玉峰 黄海荣 许四宏

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染性疾病,我国目前仍是全球结核病高负担国家之一,同时也是耐药结核病负担较高的国家[1-2]。结核病的实验室检测手段主要有细菌学检查、免疫学检查和分子生物学检查[3]。其中细菌学检查常用的两种检查方法为痰涂片检查(即抗酸杆菌染色,简称“抗酸染色”)及分枝杆菌分离培养[4-6]。在抗酸染色检查中,结核分枝杆菌复合群(MTBC)和非结核分枝杆菌(NTM)均可被检测为阳性结果,因此难以区分[7]。而传统分离培养鉴别MTBC与NTM菌群的操作步骤繁琐,耗时过长。分子生物学方法具有快速和敏感度高的特点。一般情况下,结核抗原检测虽然敏感度低于分子生物学方法,但一般采用免疫层析法,较分子生物学方法具有操作简便、成本更低和对环境和设备要求低的优势[8]。因此,结核抗原检测是目前临床上仍然使用的一种辅助诊断方法。

目前,我国国家药品监督管理部门批准上市的结核抗原检测试剂基于的方法均为免疫层析法(胶体金法),被测物(靶抗原)均为结核MPT64抗原。MPT64蛋白是MTB培养早期即分泌至菌体外部占比最大的一种可溶性蛋白,而NTM 菌株中缺乏该基因,因此可以通过检测MPT64蛋白来鉴别MTBC与NTM[9-10]。但是,由于不同包被抗体和生产工艺等因素会造成市场上的结核抗原检测试剂性能的差异,因此,研制结核抗原检测试剂国家参考品用于结核抗原诊断试剂的质量控制及评价具有重要意义。

资料和方法

一、参考品原料

参考品原料(菌株)样本均来自首都医科大学附属北京胸科医院结核分枝杆菌检验参比实验室(北京胸科医院菌种资源库),为经过分离培养、菌种鉴定并保存于―80 ℃甘油的菌株,共计11份。

二、试剂

中性罗氏固体培养基(斜面)为珠海贝索生物技术有限公司生产。对硝基苯甲酸试剂为北京胸科医院结核分枝杆菌检验参比实验室自行配制。参考品的复核试剂为成都博奥晶芯生物科技有限公司生产的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)及厦门致善生物科技股份有限公司生产的分枝杆菌鉴定试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)。协作标定的试剂包括杭州创新生物检控技术有限公司的结核分枝杆菌抗原检测试剂盒,以及美艾利尔(中国)医疗器械有限公司的结核分枝杆菌抗原检测试剂盒。

三、研究方法

1.菌株复苏和复核:将参考品原料菌株从―80 ℃进行复苏和固体培养,并使用对硝基苯甲酸生长试验进行菌种鉴定。复核选择两种检测试剂对复苏培养后的原料(菌株)样本进行检测,检测操作和结果判定均严格按照试剂盒说明书进行,确定出可用于制备国家参考品的候选样本。

2.参考品的分装和组装:分装和组装前先将所有候选样本使用中性罗氏固体培养基(斜面)进行增菌培养,阴性和阳性参考品候选样本接种8支,最低检出限/精密度参考品候选样本接种10支。将菌体磨菌超声分散后进行稀释,分装至1.5～2 ml非螺口锥形底离心管中,并置于恒温金属浴加热块上,80 ℃ 加热灭活1 h。再将每11支参考品候选样本组装成1套参考品(盘),共组装80套。用于之后的协作标定和稳定性评估。

3.参考品的协作标定研究和质量标准的制定:参考品候选样本送至杭州创新生物检控技术有限公司和美艾利尔(中国)医疗器械有限公司的实验室,使用各自生产的结核抗原检测试剂盒(胶体金法)进行协作标定并确定质量标准。试剂盒的检测操作和结果判定均严格按照试剂盒说明书进行。

4.标定菌落形成单位(CFU)计数和核酸拷贝数:所有参考品候选样本菌液在超声分散后分装前均进行了麦氏浊度检测,同时进行CFU计数实验。在CFU实验中,菌液按3个稀释度稀释,每个稀释度接种2个5 cm固体平板,对菌落为10～50个的平板进行菌落计数。参考品候选样本菌液分装并灭活后,委托广州达安基因股份有限公司使用荧光定量PCR和数字PCR法对参考品的核酸拷贝数进行标定。由于目前对NTM的CFU计数及核酸标定缺乏公认的和稳定的方法,因此仅对阳性参考品、最低检出限/精密度参考品进行CFU计数和核酸标定。

5.均匀性研究:随机抽取分装后于―20 ℃保存的5套参考品,对每套参考品(盘)中的阳性参考品、最低检出限参考品用同一批杭州创新生物检控技术有限公司生产的结核抗原检测试剂分别进行检测。

6.稳定性研究:结核抗原国家参考品分装和组装完成后存于―20 ℃冰箱中,分别取出1套于4 ℃放置7 d、于室温(23～27 ℃)放置3 d、反复冻融5次后,与-20 ℃保存的参考品同时用同一批杭州创新生物检控技术有限公司生产的结核抗原检测试剂分别进行检测。

结 果

一、菌株复苏

参考品原料(菌株)包括5份阳性参考品原料(菌株)样本,5份阴性参考品原料(菌株)样本,1份最低检出限/精密度参考品原料(菌株)样本,共计11份。其中最低检出限/精密度参考品候选样本为国际通用的标准菌株H37Rv。阳性参考品候选样本均为北京胸科医院结核分枝杆菌检验参比实验室分离自临床痰液样本的MTB菌株,并使用对硝基苯甲酸生长试验进行菌种鉴定。其余样本引进自美国菌种保藏中心(ATCC),由北京胸科医院结核分枝杆菌检验参比实验室复苏培养和传代保存。参考品原料(菌株)的具体信息见表1。

表1 候选样本来源概况

二、菌株的复核

对菌株样本采用基于核酸方法学的分枝杆菌鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法和荧光PCR熔解曲线法)进行复核,挑选出拟进入协作标定的候选样本。复核结果显示,博奥芯片对阴性参考品2号原料(菌株)样本的检测结果为堪萨斯分枝杆菌和MTB双阳性(MTB信号非常弱,因此软件自动判读为单一堪萨斯分枝杆菌),而厦门致善试剂为单一堪萨斯分枝杆菌阳性,没有检出MTB污染。考虑到芯片法的检测限一般劣于荧光PCR法,阴性参考品2号原料(菌株)样本复核为单一堪萨斯分枝杆菌阳性。此外,对于阳性参考品35号原料(菌株)样本,厦门致善试剂的检测结果为MTB和“其他分枝杆菌”双阳性,博奥芯片的检测结果为MTB和胞内分枝杆菌双阳性。该样本为临床分离株,因此可以认定该样本很大可能性为MTB和NTM混合感染。考虑到阳性参考品的设置目的为考核结核抗原试剂的阳性检出能力,因此保留其为阳性参考品候选样本。综上,复核结果表明原料菌株样本经复核均可用于制备参考品候选样本。

三、参考品的分装和组装

所有候选样本使用中性罗氏固体培养基(斜面)进行增菌培养,经稀释后分装阳性参考候选样本5支,编号为P1～P5;阴性参考样本5支,编号为N1～N5,以及最低检出限/精密度参考品,编号为P0,各样本含量均为1 ml/支,存于―20 ℃冰箱中。

四、协作标定(适用性验证)和质量标准的制定

标定结果显示,参与协作标定(适用性验证)的两家公司的试剂对阳性参考品候选样本和阴性参考品候选样本均能正确检出(表2)。在最低检出限方面,对参考品Rv倍比稀释后,杭州创新生物检控技术有限公司可检出32倍阳性、64倍阴性;美艾利尔(中国)医疗器械有限公司可检出16倍阳性、32倍弱阳性、64倍阴性。在精密度方面,对候选样本Rv进行8倍稀释后,各试剂的10次平行检测结果均为阳性,且显色均一。

表2 胶体金法试剂协作标定结果

根据协作标定结果,从协作标定样本中选择全部候选样本作为国家参考品的最终组成,并重新编号。同时根据协作标定结果,国家参考品的组成和质量标准确定为:(1)阴性参考品N1～N5:检测结果应均为阴性,阴性参考品符合率应为5/5;(2)阳性参考品P1～P5:检测结果应均为阳性,阳性参考品符合率应为5/5;(3)最低检出限参考品P0:对参考品P0进行倍比稀释至64倍,16倍稀释的检测结果应为阳性;(4)精密度参考品P0:对参考品P0进行8倍稀释后平行检测10次,检测结果应均为阳性,且显色条带均一。

五、标定CFU计数和核酸拷贝数

对于CFU计数和核酸拷贝数的标定结果见表3,其中核酸标定为单独2次上机结果的平均值,标定结果可供未来换批时参考。CFU计数结果为1次实验结果,为2个5 cm固体平板上菌落数的平均值。

表3 参考品CFU计数和核酸拷贝数标定结果

六、稳定性和均匀性研究

检测以胶体金法试剂的检测条带为指标,本参考品在4 ℃放置7 d、室温(23～27 ℃)放置3 d、反复冻融5次后,与对照参考品(―20 ℃保存)检测结果均为阳性且显色条带均一,无肉眼可见差别;随机抽取的5份参考品检测结果均为阳性且显色条带均一,无肉眼可见差别。根据上述结果,本参考品的稳定性和均匀性均符合规定要求。

讨 论

目前,用于结核病检测的金标准仍然是微生物培养和菌种鉴定,但该方法操作复杂、耗时长,并且对操作者的专业技术要求较高[11-13]。与上述方法相比,抗原检测具有操作简单、快速等优点,并且可用于现场即时检测[14-15]。为满足疾病控制及临床诊断的需要,很多研究机构及企业相继开发出多种结核抗原检测试剂盒。为了对结核抗原检测试剂的质量进行标准化研究,本研究首次建立了一套针对胶体金免疫层析法结核抗原检测试剂盒的国家参考品(盘)。本参考品(盘)的特点在于:(1)本参考品的最低检出限参考品为国际公认的结核分枝杆菌标准菌株H37Rv,遗传和生物学背景清楚,易于参考品批次更换时的质量控制。(2)胶体金法试剂的样本上样体积较大,这就要求本参考品原料的初始培养和收获菌量大。各参考品原料样本均经过两种方法的分散,力图保证在较高浓度(3～4个麦氏浓度)下制备的参考品尽量均匀,后期均匀性研究也显示参考品达到较好的均匀性。(3)本参考品的最低检出限参考品经过CFU计数和核酸拷贝数的双重标定,所提供的信息更充分。

本结核抗原国家参考品经原料复核,并经分散稀释、分装和组装后,使用两家不同企业的胶体金法结核抗原检测试剂进行协作标定(适用性验证),并使用结核核酸检测试剂盒进行拷贝数标定。通过检测相同的参考品样本,两种试剂在阳性和阴性参考品符合率、最低检出限和精密度等性能指标方面没有显示出明显差异。这与2021年完成的一项荟萃了46篇研究文献的系统综述的结论一致[8]。本研究也发现,试剂间的最低检出限也存在一定的差异。对最低检出限参考品的检测结果显示,试剂间存在2倍稀释度的差异(5×105～1×106CFU/ml),而张院良等[10]针对两种商品化MPT64结核抗原检测试剂的比较研究发现,检出限存在约3倍稀释度的差异(3×103～1×104CFU/ml)。近年来,商品化MPT64结核抗原检测试剂的实验室分析性能评估的研究较少,2项国外研究结果显示,胶体金法的MPT64结核抗原检测试剂的最低检出限在105CFU/ml 浓度水平[16-17],而本研究参考品适用性验证所用试剂也表现出该浓度水平的最低检出限,据此我们设定了参考品的最低检出限标准。此外,有研究显示,部分结核抗原检测试剂在检测NTM(如脓肿分枝杆菌)时会出现假阳性结果[10, 18],但在本研究中没有发现适用性验证所用试剂的交叉反应,提示所用试剂特异度高。因此,上述适用性验证的结果显示,本参考品(盘)能够满足胶体金法结核抗原检测试剂盒的质量评价和控制要求。参考品(盘)的组成和检测结果要求(质量标准)也考虑到结核抗原检测在临床上的应用需求,兼顾了试剂对阴性和阳性样本的检出能力。稳定性和均匀性研究显示,本参考品的稳定性和均匀性符合规定要求,可以持续供应,可为结核抗原检测试剂的质量稳定提供基础。

本参考品(盘)具有以下局限性:(1)样本来源均为菌株培养稀释、分装制得,缺少临床样本。这主要是考虑到结核病的常见临床样本为痰液样本,其成分比较复杂,不宜采用痰液等临床样本建立参考品。(2)受限于原料来源的限制,对阴性参考品并没有选择其他具有挑战性的样本进行干扰,例如其他呼吸道疾病患者的样本。(3)本参考品使用两种商品化结核抗原检测试剂进行协作标定,其靶抗原均为MPT64蛋白且均基于胶体金法,这限制了本参考品的适用性。后续将持续关注结核抗原检测方法的发展和新产品的推出,并研制适用的国家参考品。

志谢感谢林元奎博士在文字修改方面对本文做出的贡献

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献石大伟:酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章、统计分析、获取研究经费;陈湘霖:修改文章;董文竹、文舒安、张婷婷和王玉峰:实施研究、统计分析;黄海荣:酝酿和设计实验、技术指导、行政/技术/材料支持;许四宏:对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持