UHPLC/MS/MS快速筛查保健食品中13种激素和11种降血糖化学药物*

杨明明，郑 佳，马璐瑶，郗存显，郭思言，张文华，母昭德

(1 山东化工技师学院，山东 枣庄 277000；2 重庆医科大学药学院，重庆 400016；3 重庆海关技术中心，重庆 400020；4 杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016；5 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016)

随着社会的快速发展，亚健康状态或慢性疾病患者不断增加，人们利用保健食品(亦称功能性食品)改善和调节自身机体功能已成为自我保健的趋势[1]。然而在保健品中添加违禁的化学药物以增强其宣称功效的现象屡有报道[2]，例如将胰岛素增敏剂吡格列酮、格列喹酮、罗格列酮以及格列奈类和α-葡萄糖甙酶抑制剂等非法添加于保健食品中[3]。这些化学药物在临床的使用有着严格的剂量要求[4]，消费者在不知情的情况下长期使用会产生各种副作用，甚至危害生命[5]。

随着保健品中的非法添加日趋严重[6]，国家对保健品市场的监管力度也在逐年加大[7]。建立高效、快速、灵敏、稳定的筛查保健品中非法添加药物的方法具有十分重要的意义。

目前保健品中非法添加药物的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)[8-11]、红外光谱法(FTIR)[12]、拉曼光谱法[13-15]、离子迁移法[16]、高效液相色谱法(HPLC)[17-19]及液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)[20-22]、液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)[23-35]等，虽然检测方法相对较多，且各有优势，但是能同时检测添加物的数量有限，因此建立快速、高效、准确、高通量地筛查保健品中的非法添加方法具有重要的意义。

HPLC-MS/MS具有强选择性和高灵敏度，是一类检测保健品中违禁药物的有效工具。本研究采用高分辨率、高质量精度和宽动态扫描范围的超高效液相色谱-四极杆/静电轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)法，并基于本研究小组已建立的近百种非法添加药物的相关质谱数据库，以13种激素类药品及11种具有降血糖功能的化学药物为分析对象(化学结构及精确分子量见图1)，建立了快速的筛查方法，为保健品中同类非法添加药物的筛选提供一定的技术参考。

图1 24种化学药物结构及精确分子量Fig.1 Chemical structures and exact mass of 24 drugs

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS，美国Thermo Fisher Scientific公司；Sartorius BS210S电子天平，德国Sartorius公司；XH-B型旋涡混合器，江苏康健医疗用品有限公司；SR-2DS强力振荡器，日本Taitec公司；N-EVAP116氮气吹干浓缩仪，美国Organomation Associates公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；Hypersil GOLD 色谱柱(150 mm×2.1 mm，Particle Size 1.9 μm)，美国Thermo Fisher Scientific公司。

甲醇、乙腈均为色谱纯，美国TEDIA公司；甲酸为色谱纯，美国Anaqur Chemical Supply公司；实验用水为超纯水，Milli-Q，Millipore，USA。

本实验所用标准品纯度均≥98%，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 研究方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取各目标物标准品0.01 g，用甲醇溶解并配制成1.000 0 g/L的标准储备液，于-18 ℃保存。

混合标准溶液：分别吸取一定量的标准储备液，用甲醇稀释配制成浓度为1.000 0 mg/L的混合标准溶液，于-18 ℃保存。

混合标准工作液：移取适量混合标准溶液，用乙腈-水(30∶70，V/V)配制成1～100 μg·L-1的系列混合标准工作液，现用现配。

1.2.2 样品前处理

片剂、口服液、速溶粉、胶囊保健食品购自重庆药店、超市。所有样品均于4 ℃避光保存。

称取2.00 g试样，置于50 mL具塞离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋混匀，强力振荡15 min，3 500 r·min-1离心3 min；准确移取5 mL上清液于15 mL洁净离心管中，40 ℃下，氮吹仪吹至近干，加入1 mL乙腈-水(30∶70，v/v)溶液溶解残渣，涡旋30 s，0.22 μm尼龙滤膜过滤，供检测。

1.2.3 色谱分析条件

色谱系统：Ultimate 3 000 UHPLC。色谱柱：Hypersil GOLD column；柱温：40 ℃；流动相：A为 2 mmol·L-1乙酸铵溶液(含0.1%(V/V)甲酸)，B为甲醇。梯度洗脱条件：0～4.0 min，5%B；4.0～22.0 min，5%B～85%B；22.0～32.0 min，85%B；32.0～35.0 min，5%B。流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL。

1.2.4 质谱条件

离子源：加热电喷雾离子源，正离子模式；扫描方式：全扫模式；鞘气：40 arb；辅助气：15 arb；电喷雾电压：3.50 kV (+)/3.50 kV (-)；毛细管温度：320 ℃；辅助气加热温度：300 ℃；扫描范围：100～1 500 m/z；分辨率：70 000 FWHM，一级全扫模式：自动增益控制：1×e6，最大进样时间：100 ms。二级扫描自动增益控制：1×e5，最大进样时间：100 ms。碰撞能：20 eV，30 eV，40 eV。目标化合物分子量(MW)，特征母离子峰，碎片离子信息总结见表1。

表1 24种化学药物的分子式，精确质量，母离子，碎片离子Table 1 The expected compounds with formula，accurate mass，precursor ions，fragment ions

1.2.5 筛查方法建立

在优化的实验条件下，通过建立的分析方法得到目标物的质谱信息，再利用本研究小组建立的化学药物的质谱数据库，运用特定的分析软件，优化涉及的实验参数，最终确定目标化合物的种类。并对建立方法的准确度，特异性以及检测限进行考察。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

不同目标物的酸性、极性等不同，等度洗脱较难实现理想的分离效果，本研究首先考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液、乙腈-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液作为流动相的分离情况。结果表明，以甲醇-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液为流动相时，各目标物分离效果与峰形良好；进一步考察在2 mmol·L-1乙酸铵水溶液加入甲酸对化合物离子化效率的影响，结果表明，加入0.1%(V/V)甲酸化合物时离子化效率较高。因此，以甲醇-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液(含0.1%(V/V)甲酸)为流动相梯度洗脱，可对所有目标物实现良好的分离。

2.2 质谱条件优化

通过Xcalibur 2.0软件(Thermo Fisher Scientific)对扫描条件进行优化。Full-MS/dd-MS/MS 扫描模式下，首先进行一级质谱分析以确定母离子；然后，对母离子进行二级质谱分析，确定碎片离子信息。经过一系列实验表明：正负扫描模式下，Full-MS、dd-MS/MS 的分辨率分别设置为 70 000 和 17 500，Full- MS 的最大进样时间(IT)为100 ms，dd-MS/MS的最大IT为50 ms，自动增益控制(AGC)分别为1 e6、1 e5，CE梯度设置为20 eV、25 eV和30 eV时，鞘气：40 arb；辅助气体：15 arb，喷雾电压：3.50 kV (+)/3.50 kV (-)，毛细管温度：320 ℃，辅助气体加热器温度：300 ℃，R-lens RF 水平为50为最佳条件。各目标化合物质谱参数见表1，质谱图见图2。

2.3 方法学评价

2.3.1 准确性

当化合物的的理论质量m/z (Expected)与检测质量 m/z (Apex)偏差(Delta，ppm)低于5 ppm时，则会得到准确的[M+H]+峰，进一步验证特征碎片离子。表1中，所有化合物经与数据库中质谱信息进行核对，均得到准确的[M+H]+峰，表明该方法的准确度较高。

2.3.2 特异性

基于本研究小组所建立保健食品中非法添加化学药物质谱数据库，当目标化合物的母离子与质量数据库中的m/z匹配时，便提取数据库中目标化合物的特征离子。实验过程中不难发现，虽然部分化合物具有类似的母离子或相似的碎片离子，如睾酮(Testosterone)和孕酮(Progesterone)具有相似的碎片离子(97.065 4和109.065 3)(表2)，但睾酮(Testosterone)的母离子为289.125 9，而孕酮(Progesterone)为315.097 4，也可辅助进行化合物验证，表明该方法具有良好的特异性。

2.3.3 检测限

以空白样品和适当浓度的基质标准溶液考察方法检测限 (Screening Detection Limits，SDL)。根据 IUPAC计算各化合物的SDL表明，在片剂，口服液，速溶粉和软胶囊中化合物的SDL分别为1.22～68.20 μg ·kg-1，2.25～101.41 μg ·kg-1，2.70～93.52 μg ·kg-1以及2.50～71.76 μg ·kg-1(表2)，表明该方法灵敏度较好。

表2 四种不同剂型保健食品中检测限Table 2 The SDLs of four kinds of different matrix

续表2

2.4 实际样品检测

表3 20种实际样品筛查结果Table 3 The detected results of 20 real samples

为考察本研究适用性，对市售的20种不同剂型保健食品进行检测。其中包括：片剂(5)、口服液(5)、速溶粉(5)和软胶囊(5)。根据“1.3”项下进行样品前处理。高于SDL的样品标记为“+”，检测结果总结于表3。

2.5 讨 论

Ultimate UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS具有强选择性和高灵敏度，但是UHPL、MS的分离、分析条件直接影响样品的分析结果。本研究分别对UHPLC的流动相组成、洗脱程序，MS分析的扫描模式、自动增益控制、喷雾电压、毛细管温度等参数进行优化和设置，确定了最佳的分析条件，并对准确性、特异性、检测限等方面进行了方法学验证，同时应用于20种样品中激素类和降血糖药物的筛查，结果表明，所建立的方法可用于快速筛查保健品中的激素类和降血糖药物。

3 结 论

随着近年来食品安全事件的频频发生，食品中非法添加残留检测和监控引起了世界各国的广泛关注，目前保健品中非法添加药物的检测方法种类较多，且各有优势，但是能同时检测添加物的数量有限。本研究组以激素类和降血糖药物为研究对象，应用Ultimate UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法，首先建立了近百种激素类和降血糖药物的质谱信息数据库，然后运用特定的分析软件，最终确定目标化合物的种类，该方法的准确度高、灵敏度好、特异性和适用性强，为保健食品中激素类和降血糖药物快速筛查提供了理论和技术支持。