猕猴桃根际土壤可培养细菌分离及溃疡病拮抗菌筛选

杨 睿,汪琳罗沙,姚 迪,唐蕴哲,张婧一,彭清忠

(吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首 416000)

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起的细菌病害,具有发生范围广、传播速度快、致病性强、防治难度大等特点,短期内极易造成大面积树体死亡[1]。目前,采用抗生素(如链霉素、春日霉素)和铜制剂(如铜氧化物、铜氢氧化物)的化学防治是主要防控措施,但该方法极易引起Psa的耐药性,并且使用后抗生素和重金属残留污染环境[2-5]。生物防治是环境友好型植物健康管理新方式,具有无污染,无残留,不杀伤天敌,不易产生抗药性,利于人畜安全及环境保护,兼防兼治,增产增收等优点,符合人们对绿色食品的需求[6]。因此,利用生物防治法控制猕猴桃溃疡病更具应用前景。

根际土壤微生物是土壤的重要组分,对于植物健康的意义可以类比为肠道微生物对于人类健康的作用,在肥力演变、物质循环及促进植物生长发育中发挥着重要作用,可直接影响作物产量和质量[7]。在根际土壤微生物中包含许多对植物有益的微生物群落,它们通过相互作用构建植物特殊免疫屏障,能够抑制病原菌,一定程度防止植物发病[8-10]。从根际土壤中筛选得到的病虫害拮抗菌,由于直接来源于土壤,作为生物防治剂具有快速适应环境的优势。基于此,笔者采用拟纯培养法从湘西地区猕猴桃植株根际土壤样品中分离细菌,进行鉴定和微生物多样性分析,然后利用牛津杯法筛选拮抗Psa的菌株,以期为猕猴桃溃疡病生物防治剂的研制积累种质资源。

1 材料与方法

1.1 样品采集以湘西地区3个猕猴桃主要种植区作为采样点,即保靖县迁陵镇(28°07′N,109°57′E),永顺县松柏镇(28°54′N,110°4′E),凤凰县阿拉营镇(27°54′N,109°22′E)的“米粮1号”和“红阳”猕猴桃果园,随机采集2种猕猴桃根际土壤样品,放入冰盒中带回实验室备用。

1.2 培养基配置LB培养基:蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母膏5 g,水1 000 mL,pH 7.0;高氏一号培养基:可溶性淀粉20.00 g,NaCl 0.50 g,KNO31.00 g,K2HPO40.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,水1 000 mL,pH 7.0。固体培养基均加入2.0%琼脂。

1.3 可培养细菌分离将采集的猕猴桃植株根际土壤样品各称取5 g,加入至装有50 mL无菌水的三角瓶中,25 ℃,150 r/min 振荡0.5 h,使土样充分分散。然后将土样稀释100倍,吸取上清液各200 μL涂布于不同培养基上。放入培养箱28 ℃恒温培养2～4 d,待培养基上长出单菌落后,记录细菌数量,挑取形态不同的单菌落,通过四分体划线纯化菌株,利用LB培养基转接3次,保存菌种。

1.4 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株总DNA,利用细菌通用引物PA/PB(PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′)对分离菌株分别进行16S rDNA序列PCR扩增,反应体系为:TaqPCR Mix (2X) 25 μL;正反引物各1 μL;模板2 μL;无菌水补齐至50 μL。PCR程序为:95 ℃预变性2.5 min;95 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃后延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验后,送至生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。将测得的序列送至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库,采用Blast工具软件搜索同源序列并进行比较分析,运用Mega 7.0软件中的邻位加入法(neighbor joining,NJ)构建系统发育树,根据同源性和系统发育关系,确定菌株的种类归属。

1.5 猕猴桃溃疡病拮抗菌株筛选供试菌株为从猕猴桃根际土壤中分离得到的细菌,供试靶标菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidae,Psa)为实验室前期分离鉴定的菌株L211。首先将供试菌株种子液按1%接种量加入液体LB培养基25 ℃,150 r/min培养48 h制成发酵液,接着分别利用离心机和冷冻真空干燥仪对上清液进行提取和浓缩备用;取200 μL靶标菌L211发酵液涂布于LB培养基上,在每个平板上放置1个牛津杯,加入200 μL供试菌株浓缩后的发酵上清液,于25 ℃恒温培养48 h,观察是否有抑菌圈产生。

2 结果与分析

2.1 可培养细菌的分离采用纯培养法从2种猕猴桃根际土壤样品中分离获得164株细菌(含放线菌)。从2种培养基的分离情况看,LB培养基分离效果较好,菌落数量和菌落形态较为丰富;高氏一号培养基分离效果相关较差,菌落形成单位低,且菌落颜色单一。综合分析菌落形态特征,去除部分冗余,最终从164株根际土壤细菌中选取142株代表菌株开展后续试验。

2.2 根际土壤细菌类群多样性提取分离菌株基因组DNA,PCR扩增获得序列长度约1.5 kb的16S rRNA基因片段,经测序和系统进化分析,初步鉴定142株细菌分别属于4门(Actinobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,Proteobacteria),6纲(Actinomycetia,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria,Bacilli,Flavobacteriia),11目(Bacillales,Burkholderiales,Corynebacteriales,Flavobacteriales,Hyphomicrobiales,Micrococcales,Pseudomonadales,Rhodospirillales,Sphingomonadales,Streptomycetales,Xanthomonadales),18科(Azospirillaceae,Bacillaceae,Boseaceae,Burkholderiaceae,Comamonadaceae,Flavobacteriaceae,Microbacteriaceae,Micrococcaceae,Micrococcales,Nocardiaceae,Paenibacillaceae,Pseudomonadaceae,Rhizobiaceae,Sphingomonadaceae,Sporolactobacillaceae,Staphylococcaceae,Streptomycetaceae,Xanthomonadaceae),28属(Azospirillum,Bacillus,Falsibacillus,Lysinibacillus,Metabacillus,Priestia,Bosea,Burkholderia,Caballeronia,Cupriavidus,Paraburkholderia,Ralstonia,Variovorax,Flavobacterium,Microbacterium,Arthrobacter,Sinomonas,Rhodococcus,Paenibacillus,Pseudomonas,Ensifer,Rhizobium,Novosphingobium,Scopulibacillus,Staphylococcus,Kitasatospora,Streptomyces,Stenotrophomonas)。其中,Firmicutes门菌株为优势菌群(70株,49.3%),其余依次为Beta-proteobacteria亚门(42株,29.6%)、Actinobacteria门(19株,13.4%)、Alpha-proteobacteria亚门(6株,4.2%)、Gamma-proteobacteria亚门(4株,2.8%)和Bacteroidetes门(1株,0.7%)。在属水平上优势属为Bacillus(62株,43.7%)(表1)。结果表明,猕猴桃根际土壤细菌具有丰富的类群多样性。

2.3 根际土壤细菌物种和遗传多样性根据系统发育分析结果,采用16S rRNA基因序列同源性≥97%可归为同一种的原则,142株细菌可归为76个物种。其中,有104株分离菌株与典型菌株16S rRNA基因序列相似性在97.03%～100%,可基本确定其分类地位;有38株细菌与典型菌株16S rRNA基因同源性在92.03%～96.87%,可能为潜在的新种或新属,分类地位有待进一步确定(表1)。这表明分离菌株与系统发育关系最密切的典型菌株之间存在较大的遗传差异,具有遗传多样性。

表1 猕猴桃根际细菌与其关系最密切典型菌株的系统发育关系Table 1 Phylogenetically closest neighbors of kiwifruit rhizosphere bacteria based on 16S rRNA gene sequence analysis

接下表续表1

接下表续表1

2.4 猕猴桃溃疡病拮抗菌筛选与鉴定以分离的142株细菌为供试菌株,通过牛津杯试验初筛,发现4株细菌(菌株编号A11、D1h、A4和B15)的发酵液在牛津杯周围出现抑菌圈(图1),说明这4株菌能够抑制溃疡病菌Psa的生长,其发酵液中可能存在拮抗Psa生长的代谢产物或降解Psa菌体成分的蛋白酶类。对4株拮抗菌进行系统发育分析,发现菌株A11和D1h与红球菌属的Rhodococcusgloberulus(MG575949、EU004416、MK356456、MT555342)聚为一支,其与关系密切典型菌株的16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;A4与芽孢杆菌属的Bacillusthuring(FJ601902.1) 、Bacilluscereus(HG800012.1) 、Bacillustoyonensis(MG561363.1)、Bacillusacidiproducens(MF446886.1) 、Bacilluswiedmannii(MW435481.1)聚为一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;B15与链霉菌属的Streptomycestriticiradicis(MN512450)聚为一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上(图2)。初步确定,菌株A11和D1h属于红球菌属(Rhodococcus),菌株A4属于芽孢杆菌属(Bacillus),B15属于链霉菌属(Streptomyces)。

3 讨论

该试验从猕猴桃根际土壤中分离获得了142株细菌,分别归属于细菌域六大系统发育类群(Actinobacteria,bacteroidetes,Firmicutes,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria)、11个目、18个科、28个属、76个物种,其16S rRNA基因序列与关系密切典型菌株相似度在92.03%～100%。可以看出,猕猴桃根际土壤细菌具有丰富的类群、物种和遗传多样性,并存在潜在的新种或者新属类群。其中,细菌优势类群为Firmicutes门(70株,49.3%),有研究表明,Firmicutes门为土壤的重要免疫细菌,在保护植物免受病原菌侵染中具有重要作用[11]。推测Firmicutes门是猕猴桃预防溃疡病的主要类群之一。

通过牛津杯试验,从142株细菌中筛选出4株有拮抗效果的细菌(A11、D1h、A4、B15),经过系统发育分析,确定菌株A11和D1h属于红球菌属,菌株A4属于芽孢杆菌属,B15属于链霉菌属。结果表明,猕猴桃根际土壤中存在拮抗溃疡病菌的微生物类群。红球菌是一种具有良好抗菌效果的革兰氏阳性菌,有研究报道,该类细菌能产生新抗生素[12],如Kurosawa等[13]从红球菌中分离出红链霉素A和红链霉素B(Rhodostreptomycin)对革兰氏阴性和阳性菌有良好的抑制活性;Kitagawa等[14-15]从红球菌中发现了一种新型喹啉类抗生素(aurachin)对表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和痤疮丙酸杆菌有良好的拮抗效果。芽孢杆菌是一类具有生防潜力的微生物,其可以通过分泌抗生素、细胞壁水解酶以及铁载体等胞外代谢产物表现出拮抗活性[16-17],杜贞娜等[18-19]报道了拮抗Psa的芽孢杆菌类群。链霉菌能够分泌多种抗生素,是目前抗生素生产应用较广的一类细菌[20-21],其分泌的链霉素是防治Psa的主要杀菌剂[22],朱云海等[23]在猕猴桃组织中发现能拮抗Psa的肉桂地链霉菌。由此可见,笔者筛选的红球菌(2株)、芽孢杆菌及链霉菌可能是生物防治猕猴桃溃疡病的优良菌株,其拮抗机理有待进一步发掘。

综上所述,猕猴桃根际土壤中可培养细菌具有丰富的类群、物种和遗传多样性,并存在拮抗溃疡病菌的微生物类群。该研究发现了拮抗Psa的红球菌属细菌,为猕猴桃溃疡病生物防治剂的研制积累了种质资源。